加味中肝合剂联合化疗治疗肝癌的作用机制研究

朱慧萍 刘振东 朱影

肝癌是全球第三大癌症，其发病率持续上升。尽管肝硬化是肝癌发生的基础，但许多分子通路参与了肝癌的发生，包括端粒酶逆转录酶启动子突变、Wnt/β-catenin、p53、Akt/mTOR、血管内皮生长因子受体和内皮生长因子受体/RAS/MAPK通路[1]。中医认为，中晚期肝癌普遍存在热毒内蕴、气滞血瘀的临床特点，临床上采用清热解毒为主、健脾行气活血为辅的中肝合剂治疗中晚期肝癌配合西药对症治疗可提高中晚期原发性肝癌患者的生活质量，延长其生存时间[2]。气阴两虚是恶性肿瘤患者的重要病理特点，益气养阴法为中医扶正培本的大法，也是治疗癌症的常法[3]。有研究指出，早期肝癌患者以肝郁脾虚型为主，中晚期患者以气阴两虚型为主。晚期患者肝癌日久，癌毒、血瘀、湿热等病邪侵犯人体，耗伤正气，气虚则血虚，日久耗损阴血，最终表现为气阴两虚[4]。生脉饮方药由一补一润一敛之药（人参、麦冬、五味子）组成，根据临床实践，本次研究将人参替换为太子参。太子参有补气健脾之功，使中焦健运，阴津生化有源。麦冬、五味子养阴生津[3]。因此，本次研究将探究加味中肝合剂（中肝合剂联合生脉饮）联合化疗药物对裸鼠肝癌移植瘤的影响，并阐明相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 中药制剂的准备 中肝合剂组方：白毛藤15 g、白茅根15 g、白花蛇舌草15 g、半枝莲15 g、三叶青9 g、重楼9 g、金钱草15 g、焦山栀9 g、三棱9 g、莪术12 g、温郁金12 g、白芍12 g、陈皮12 g、青皮12 g、焦山楂9 g、炙鸡内金5 g。加味中肝合剂组方在中肝合剂组方的基础上增加：白毛藤15 g、太子参15 g、麦冬12 g、五味子6 g。两方分别加水煎煮两次，头煎40 min，二煎30 min，滤取两次煎出液，合并、沉淀、吸取上清液浓缩至200 ml，分装、封口、湿热蒸汽灭菌，贴标签备用。

1.2 动物造模与分组 取BALB/c 雄性裸小鼠，5 周龄，体重约16 g左右。取5×106/0.2 ml细胞浓度的Bel-7404 人肝癌细胞，用无菌注射器接种于裸鼠右前腋窝皮下。待皮下肿瘤最长径长至≥1.5 cm后，用乙醚吸入法麻醉并处死裸鼠，完整切除肿瘤，放入含100 U/ml青霉素、链霉素的0.9%氯化钠注射液中，反复漂洗2～3 次，每次5 min，剔除周围结缔组织，取肿瘤边缘生长旺盛的组织切成直径1.5 cm×1.5 cm 的肿块，用套管针把组织送至另一只裸鼠的腹股沟，依此法传代一次。待肿瘤组织第三代最短直径长至≥1.5 cm 时，以此作为肝癌组织皮下移植材料，取肿瘤边缘生长旺盛的组织无菌条件下切成约1.5 cm×1.5 cm大小，用套管针把瘤组织送至裸鼠右前腋窝皮下，术后不使用抗生素，共计50只裸鼠。移植2 周后，50只裸鼠随机分为五组：模型组、中肝合剂组、加味中肝合剂组、化疗组、加味中肝合剂与化疗联合治疗组，每组各10只。模型组不加任何药物干预，予0.9%氯化钠注射液灌胃对照；中肝合剂组以浓缩的中肝合剂0.4 ml灌胃，每天1 次；加味中肝合剂组以浓缩的加味中肝合剂0.4 ml 灌胃，每天1 次；化疗组以5-氟尿嘧啶剂量30 mg/kg 经鼠尾静脉注射，每2 天1 次；联合治疗组结合中药灌胃与5-氟尿嘧啶静脉注射。五组用药时间均为2 周。

1.3 方法

1.3.1 抑瘤率测定 给药结束24 h 后处死全部荷瘤小鼠，切开肿瘤周围皮肤，完整剥离肿瘤，去除脂肪组织并称重。将瘤组织用消毒锡箔纸包裹后迅速置于超低温冰箱冻存。比较各组小鼠肿瘤的平均重量，并按公式计算抑瘤率。

抑瘤率=（阴性对照组平均瘤体重量-实验组平均瘤体重量）/ 阴性对照组平均瘤体重量×100%。

1.3.2 实时荧光定量PCR 技术检测p27 基因表达 取瘤体组织剪碎，加入Trizol 研磨，高速离心后转上层水相于另一EP管中，加氯仿摇匀振荡再离心取上清后加异丙醇，摇匀、离心弃上清，加入75%乙醇，振荡器混匀再离心后沉淀用DEPC水溶解，冲吸混匀完全备用。逆转录RT；设计并合成引物，建立PCR反应体系，PCR扩增；完成溶解曲线试验及定量数据分析。

1.3.3 Western blot检测KLF8蛋白表达 将配制好的蛋白裂解液1 ml加入匀浆管中，加入称量好的组织块，在冰盒中匀浆，将匀浆液以15 000 r/min离心后取上清，测定提取物中蛋白含量。调整样品蛋白浓度为400 μg/ml。将样品及蛋白标准品分别加入等体积的蛋白电泳上样缓冲液，煮沸5 min，使蛋白质变性。SDS-PAGE 电泳、转膜，将转移膜置于5%脱脂奶粉摇动1.5 h封闭。洗膜后二抗孵育，二氨基联苯胺显色，将显色完毕的膜用凝胶成像仪显像。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（）表示，多组数据采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法（最小显著性法）。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同给药组治疗后对裸鼠肝癌组织瘤重和抑瘤率的影响见图1和表1

表1 不同给药组治疗后对肝癌组织瘤重和抑瘤率的影响

图1 不同给药组治疗后对裸鼠肝癌组织瘤重和抑瘤率的影响

由图1 可见，不同给药组瘤体大小直径比较：模型组＞中肝合剂组＞加味中肝合剂组＞化疗组＞联合治疗组，瘤体质量减轻明显。

由表1 可见，模型组、中肝合剂组、加味中肝合剂组、化疗组、联合治疗组瘤体重量逐渐减轻，差异有统计学意义（F=28.42，P＜0.05），抑瘤率逐渐增强。

2.2 不同给药组治疗后肝癌组织中p27mRNA表达见表2

表2 不同给药组治疗后肝癌组织中p27mRNA表达

由表2可见，五组肝癌组织中的p27mRNA的表达比较，差异有统计学意义（F=19.73，P＜0.05）。与模型组比较，中肝合剂组p27mRNA表达无明显差异（t=-1.78，P＞0.05），而加味中肝合剂组、化疗组、联合治疗组的肝癌组织中的p27mRNA 表达均明显升高，差异均有统计学意义（t分别=-4.37、-7.41、-7.59，P均＜0.05）。

2.3 不同给药组治疗后肝癌组织中KLF8蛋白表达见图1和表3

表3 不同给药组治疗后肝癌组织中KLF8蛋白表达

图1 不同给药组治疗后肝癌组织KLF8蛋白表达

由图1 可见，与模型组比较，中肝合剂组、加味中肝合剂组、化疗组、联合治疗组的肝癌组织中的KLF8蛋白表达均有所降低。

由表3可见，五组肝癌组织中的KLF8 蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=41.12，P＜0.05）。与模型组比较，中肝合剂组KLF8 蛋白表达无明显差异（t=1.14，P＞0.05），而加味中肝合剂组、化疗组、联合治疗组的肝癌组织中的KLF8蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义（t分别=5.96、7.51、11.63，P均＜0.05）。

3 讨论

何福根等[5]研究明确指出中肝合剂能预防化疗药物对肝脏的损害。肝癌射频术后患者常存在气阴两虚的证候特点，治疗以益气养阴为主，可改善肝癌患者的相关症状，提高其生存质量[6]。有研究指出，生脉饮加味联合化疗治疗气阴两虚型老年晚期非小细胞肺癌不仅可以改善患者的免疫水平，还可以降低不良反应发生率[7]。生脉饮联合百合固金汤治疗老年中晚期气阴两虚证肺癌化疗患者有增效减毒作用[8]。生脉饮注射液辅助治疗放疗后气阴两虚证直肠癌可明显减轻临床症状，调节机体免疫功能[9]。本次研究结果显示，模型组、中肝合剂组、加味中肝合剂组、化疗组、联合治疗组瘤体重量逐渐减轻（P＜0.05），抑瘤率逐渐提高。说明加味中肝合剂联合化疗组较于单纯化疗组或者加味中肝合剂组抑制肝癌细胞增殖的效果更强，中肝合剂联合生脉饮具有增强化疗药物对荷瘤裸鼠肝癌细胞增殖的抑制作用。

本次研究结果显示，与模型组比较，中肝合剂组、加味中肝合剂组、化疗组、联合治疗组的肝癌组织中的p27mRNA表达均明显升高（P均＜0.05）。说明加味中肝合剂联合化疗组治疗后较于单纯化疗组或者加味中肝合剂组，上调p27mRNA表达的作用更强，进而较强地抑制荷瘤裸鼠肝癌细胞的增殖，从而发挥其更强的抗肿瘤作用。p27 通过影响细胞周期依赖性复合物CDK6/CCND1 的形成来调节细胞周期，抑制细胞增殖，但不直接影响CDK6 和CCND1 的表达。喉鳞状细胞癌中CyclinE 基因的激活使p27 基因表达下调，使得处于发育过程的细胞过多地进入细胞周期，导致肿瘤的发生乃至浸润和转移，患者的预后较差[10]。E6AP 通过以E2F1依赖的方式抑制p27 的转录来调节p27 的表达。同时下调E6AP 和p27 可部分恢复前列腺癌细胞的生长[11]。

KLF8在胃癌中的表达显著高于正常胃组织，其高表达可能与肿瘤的侵袭转移有关，对胃癌诊断及预后评估具有重要参考价值[12]。KLF8 通过直接结合到E-cadherin 启动子的TG 盒，抑制基因启动子，从而诱导上皮间质转化的发生，参与结肠癌的发生、发展[13]。干扰KLF8 后能够抑制骨肉瘤细胞中STAT3 的磷酸化水平，KLF8 可能通过作用于STAT3 信号通路影响骨肉瘤细胞的生长[14]。KLF8在肝癌中通过PI3K/AKT 信号通路诱导血管内皮生长因子A 的表达，KLF8 表达上调的肝癌细胞具有更强的诱导新生血管生成的潜能[15]。本次研究结果显示，与模型组比较，不同给药组治疗后肝癌组织中的KLF8 蛋白表达均明显降低（P均＜0.05）。说明加味中肝合剂联合化疗组治疗后较于单纯化疗组或者加味中肝合剂组，下调KLF8 蛋白表达的作用更强，进而可能较强地抑制荷瘤裸鼠肝癌细胞的侵袭转移、上皮间质转化以及肝癌组织内新生血管的生成，从而增强其抗癌作用。KLF8 在肝癌中起转录抑制因子的作用，主要直接调控凋亡相关基因。KLF8 基因敲除促进了细胞凋亡过程，并导致相关的H3K27ac 增加，从而抑制高迁移率族蛋白或基质金属蛋白酶的生物学效应[16]。KLF8在肺癌中的上调促进了肺癌细胞的增殖和集落形成。KLF8 与JMJD2A 启动子结合，进而调节P21 和CDK4 的表达，从而参与KLF8 对细胞周期的调控[17]。

综上所述，加味中肝合剂联合5-氟尿嘧啶能够显著抑制裸鼠肝癌的生长增殖，效果优于化疗组、加味中肝合剂组以及中肝合剂组，且肝癌组织中的抑癌基因p27mRNA 明显升高，而促癌因子KLF8 蛋白表达明显降低，推测其作用机制可能与抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡相关。