黄婷婷 贾巧飞 金卫斌 陶磊
喉鳞癌病因复杂,普遍认为与吸烟、饮酒、职业因素及病毒感染等有关[1]。因此,加强喉鳞癌患者早期诊断、治疗对改善患者预后具有重要的意义。内皮抑素(Endostatin)是在实体瘤中发现的一种蛋白质,能抑制内皮细胞增殖[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2)均为促进血管形成重要因子,能刺激内皮细胞分泌集中蛋白酶与蛋白酶活化因子,促进新生血管形成[3,4]。目前临床上Endostatin、VEGF 及FGF-2 在喉鳞癌患者中的表达及与喉鳞癌发生、发展的相关性研究较少。因此,本次研究采用随机对照研究探讨Endostatin、VEGF 及FGF-2 在喉鳞癌患者中的表达及与疾病发生的相关性及临床价值。现报道如下。
1.1 一般资料 选择2018 年5 月至2020 年5 月在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院头颈外科治疗的喉鳞癌患者59 例设为观察组,其中男性33 例、女性26 例;年龄36~85 岁,平均(52.49±7.93)岁;肿瘤直径1~7 cm,平均(4.12±0.57)cm。分化类型:高分化21 例、中分化26 例、低分化12 例;淋巴结转移:是34 例、否25 例;TNM 分期:Ⅰ期21 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期9 例、Ⅳ期14 例;肿瘤部位:声门上型14 例、声门型31 例、声门下型4 例。选择同期非喉部肿瘤手术治疗患者56 例设为对照组,其中男性31 例、女性25 例;年龄35~86 岁,平均(53.11±7.95)岁。两组临床资料比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。
1.2 纳入及排除标准 纳入标准为:①观察组患者均符合喉鳞癌诊断标准[5],均经手术病理确诊;②观察组与对照组患者均拟行手术治疗,术中均取病灶组织;③能在医生指导下完成有关检查、诊断、治疗。排除标准为:①合并其他喉部疾病或其他部位恶性肿瘤或病历资料不全者;②近3 个月使用放化疗或对本研究结果产生影响者;③合并凝血功能异常、精神异常或伴有自身免疫系统疾病者。
1.3 方法 取观察组病灶组织与癌旁组织及对照组病灶组织,加入蒸馏水与浓度为30.0%H2O2,常温下加入内源性酶并进行10 min 灭火,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)连续进行3 次洗涤。将最终获得的切片放置在0.01 mol/L 枸橼酸盐缓冲液中,加入0.9%氯化钠注射液控制溶液pH 值最终为6。电炉加热直到煮沸,5 min 间隔后再次煮沸,常温下冷却。采用PBS 2 次洗涤,每次5 min,最后加入5%BSA封闭液并加入兔抗人Endostatin、VEGF及FGF-2 蛋白抗体(1:100),兔抗人Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白一抗,各一滴。滴加完毕后进行3 次PBS 洗涤;在1 ml 底物中加入兔抗人Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白二抗一滴,混合后常温下显色,苏木精复染后封片,倒置显微镜下观察细胞数量,每份标本测定三次,取平均值[6]。
1.4 阳性评价标准 参考奥尔雷德评分标准分别从细胞的阳性数量(阳性细胞数≤25.0%0 分,26%~50.0%1 分,51%~75%2 分,>75%3 分)、染色强度(不着色0 分,黄色1 分,棕黄色2 分,黄褐色3 分)对染色效果进行评分,总分16 分,评分越高阳性率越高[7,8]。
1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差()表示。计量资料比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验。采用Spearman相关性分析Endostatin、VEGF 及FGF-2 与喉鳞癌发生的相关性。设P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 两组Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率比较见表1
表1 两组Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白阳性率比较/例(%)
由表1可见,观察组癌旁组织与对照组Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率比较,差异均无统计学意义(χ2分别=1.79、2.08、1.43,P均>0.05);观察组病灶组织中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率均高于癌旁组织和对照组(χ2分别=10.39、12.14、7.94、6.97、10.85、9.24,P均<0.05)。
2.2 两组Endostatin、VEGF 及FGF-2 免疫组化结果见图2
图2 两组Endostatin、VEGF及FGF-2免疫组化染色图(×200倍)
由图2可见,观察组病灶组织中Endostatin、VEGF 及FGF-2 呈高表达,喉细胞出现不同程度坏死,纤维增生更加明显;而对照组组织中表达水平较低。
2.3 观察组不同临床特征中Endostatin、VEGF 及FGF-2蛋白阳性率见表2
表2 观察组不同病理组织中Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白阳性率比较/例
由表2 可见,观察组喉鳞癌组织中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率与性别、年龄、肿瘤部位无统计学意义(F分别=1.29、0.64、1.29,P均>0.05);喉鳞癌组织中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期及分化程度具有统计学意义(F分别=6.75、5.09、4.55、7.89,P均<0.05)。
2.4 Endostatin、VEGF 及FGF-2 阳性表达与喉鳞癌发生相关性分析Spearman相关性分析结果显示,喉鳞癌发生与Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白阳性表达呈正相关性(rs分别=0.59、0.56、0.62,P均<0.05)。
喉癌是临床上常见的恶性肿瘤,多数患者以原发性喉鳞癌为主,且随着人们生活方式的改变,导致喉鳞癌发生率呈上升趋势,影响患者健康、生活。国内学者研究表明[9]:血管生成与肿瘤生物学存在紧密的联系,且经实体瘤证实其生长、增殖与血管的生成存在紧密的联系。临床研究表明肿瘤微血管密度与肿瘤的表型、生物学行为有关,新生血管不仅能为肿瘤提供所需的营养成分,并运送代谢废物,并以旁分泌形式刺激肿瘤的生长,促进肿瘤细胞进入血液循环中,加速肿瘤的浸润、转移[10]。
目前,临床上已经发现多种具有抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤血管生成的活性物质。Endostatin是最为理想的促进因子,属于是一种蛋白质,且经氨基酸序列显示该物质为胶原XVIIIC 末端非胶原区的氨基酸片段。临床研究表明Endostatin 在生物学活性上能抑制内皮细胞的增殖,且常伴有诱导凋亡作用,而对非内皮细胞无增殖、抑制作用。Endostatin 能抑制多种抑制肿瘤的生长,能诱发原发肿瘤消退或进入休眠期,不会对动物产生影响[11]。VEGF 及FGF-2 是促进血管形成的重要因子,能刺激内皮细胞分泌,导致血管基底膜降解,能加速肿瘤细胞的迁移、增殖,从而形成新的、含有空腔的血管[12]。国内学者研究表明:VEGF 及FGF-2 表达水平与血管的形成有关,能加速肿瘤的转移与生长[13]。本次研究结果显示,观察组癌旁组织与对照组Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率比较均无统计学差异(P均>0.05);观察组病灶组织中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性率均高于癌旁组织与对照组(P均<0.05);免疫组化结果表明:观察组病灶组织中Endostatin、VEGF 及FGF-2蛋白呈高表达,喉细胞出现不同程度坏死,纤维增生更加明显;而对照组组织中表达水平较低,说明Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白在喉鳞癌患者中呈高表达,能参与疾病的发生、发展。这与胡盘林等[14]、Xu等[7]研究一致。
目前,临床上对于抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤血管生成物质相对较多,但是Endostatin、VEGF及FGF-2 蛋白在喉鳞癌中表达及与肿瘤发生、发展的影响研究较少[8]。本次研究发现喉鳞癌组织中Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白阳性率与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期及分化程度明显相关(P均<0.05),表明Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白在喉鳞癌患者中表达受到的影响因素较多,其表达水平能反映患者的肿瘤分期、肿瘤大小、分化程度及淋巴结转移情况,能帮助患者早期确诊,为临床诊疗提供依据和参考。国内学者研究表明:通过抑制肿瘤血管生成能抑制肿瘤的生长,且当肿瘤直径低于1~2 mm 时,肿瘤细胞则可以通过弥散方法完成营养成分的吸收,该时间段无血管的形成,导致肿瘤生长受到抑制。但是,随着肿瘤的不断发展,且能分泌调节因子时,则可以生产血管,加速肿瘤的发生、发展[15]。为了进一步分析喉鳞癌组织中End⁃ostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白与疾病发生的关系,研究中对两者进行Spearman相关性分析,结果表明:喉鳞癌发生与Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白阳性表达呈正相关(P均<0.05),表明Endostatin、VEGF及FGF-2 蛋白阳性表达水平与喉鳞癌的发生有关,加强其水平测定能实现患者早期诊疗。
综上所述,Endostatin、VEGF及FGF-2在喉鳞癌患者中呈高表达,能反映患者疾病严重程度,且与喉鳞癌的发生、发展存在相关性,能为临床诊疗提供依据和参考。但目前仍需更多临床数据确定Endostatin、VEGF 及FGF-2 在喉鳞癌患者中的诊断标准。