急性脑梗死患者外周血miR-497-5p表达的变化及临床意义

王娜 刘敏 傅美丽

急性脑梗死（Acute cerebral infarction，ACI）是我国常见的心脑血管疾病之一，具有发病率高、致残率高、复发率高的特点。颅内动脉闭塞后脑组织发生缺血缺氧损害是急性脑梗死基本的病理生理特征，在缺血缺氧过程中炎症反应、氧化应激反应的激活会加重神经功能损害［1-2］。近些年，越来越多的学者以炎症反应、氧化应激反应为切入点研究急性脑梗死的发病机制。微小RNA（microRNA，miR）是一组不具备转录功能的小分子RNA，广泛表达于全身多个组织且发挥多样的生物学作用。有动物实验发现，大鼠大脑中动脉闭塞后miR-497-5p 的表达显著增加，抑制miR-497-5p 能够减轻大脑中动脉闭塞小鼠神经功能的损害，同时也改善炎症反应和氧化应激反应［3］。但miR-497-5p 在急性脑梗死发病中与炎症反应、氧化应激及的关系尚缺乏足够的临床证据。因此，本研究将以急性脑梗死患者为对象，探究外周血miR-497-5p 表达与炎症因子、氧化应激产物释放及90 d 预后的关系，旨在阐明miR-497-5p 在急性脑梗死发病中的作用及可能机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2018年4月至2020年4月期间本院收治的急性脑梗死患者作为急性脑梗死组，入组标准：①符合指南中急性脑梗死的诊断标准［4］；②发病至入院时间＜6 d，未接受过溶栓或介入治疗；③临床资料及样本完整。排除标准：①既往有脑梗死、心肌梗死、脑外伤病史；②合并恶性肿瘤、急慢性感染。另取同期体检的健康志愿者作为对照组。急性脑梗死组共132 例，包括男性78 例、女性54 例，年龄平均（59.39±10.92）岁；对照组共106 例，包括男性67 例、女性39 例，年龄平均（57.51±11.34）岁。两组间一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究取得医院伦理委员会批准，取得研究对象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miR-497-5p 表达水平的检测

急性脑梗死组患者入院后24 h 内取外周静脉血1～3 mL，对照组志愿者体检时取外周静脉血1～3 mL，采用试剂盒（北京天根生化公司、批号DP433）提取外周血中的miR，将miR 反转录为相应的cDNA 后进行荧光定量PCR 反应，反应所用引物为目的基因miR-497-5p 的特异性引物及内参基因U6 的特异性引物，在荧光定量PCR 仪（美国Bio-rad 公司，型号：CFX96）上完成PCR 反应后得到反应曲线，根据曲线对应的循环阈值、以U6 为内参计算miR-497-5p 的表达水平。计算急性脑梗死组患者外周血miR-497-5p 表达水平的中位数，表达水平≥中位数为高表达、＜中位数为低表达。

1.2.2 血清炎症因子及氧化应激产物的检测

急性脑梗死组患者入院后24 h 内取外周静脉血3～5 mL，对照组志愿者体检时取外周静脉血3～5 mL，静置30 min 后3 000 r/min 离心10 min，分离上层血清后采用试剂盒（上海西唐公司）检测白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、晚期蛋白氧化产物（advanced oxidation protein products，AOPP）、8-羟基脱氧鸟苷酸（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）的含量，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 90 d 预后的评估

急性脑梗死发病后第90 d 时，采用门诊复查或电话回访的方式进行随访，根据改良Rankin 量表（Modified Rankin Scale，mRS）评分评价预后，mRS评分＞2 分为预后不良、mRS 评分≤2 分为预后良好。

1.2.4 观察指标

两组患者外周血miR-497-5p 表达水平，血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、AOPP、8-OHdG 的含量，预后情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件及Prism6.0 软件进行统计学分析；计量资料以下（）表示，两组间比较采用t检验；miR-497-5p 预测预后采用ROC 曲线分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性脑梗死组与对照组外周血miR-497-5p表达水平的比较

急性脑梗死组(1.30±0.42)患者外周血中miR-497-5p 的表达水平高于与对照组(1.00±0.26)，差异有统计学意义（t=6.430，P＜0.05）。

2.2 急性脑梗死组中miR-497-5p 低表达与高表达患者血清炎症因子的比较

急性脑梗死组中miR-497-5p 高表达患者的血清IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量与miR-497-5p 低表达患者比较升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 急性脑梗死组中miR-497-5p 低表达与高表达患者血清炎症因子的比较（±s）Table 1 Comparison of serum inflammatory factors between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

表1 急性脑梗死组中miR-497-5p 低表达与高表达患者血清炎症因子的比较（±s）Table 1 Comparison of serum inflammatory factors between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

miR-497-5p 表达高表达低表达t 值P 值n 66 66 IL-1β(ng/mL)2.15±0.62 1.77±0.45 4.030 0.000 IL-6(pg/mL)5.87±1.04 4.95±0.83 5.617 0.000 TNF-α(ng/mL)22.93±7.68 19.47±5.23 3.025 0.003

2.3 急性脑梗死组中miR-497-5p 低表达与高表达患者血清氧化应激产物的比较

急性脑梗死组中miR-497-5p 高表达患者的血清MDA、AOPP、8-OHdG 的含量与miR-497-5p 低表达患者比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 急性脑梗死组中miR-497-5p 低表达与高表达患者血清氧化应激产物的比较（±s）Table 2 Comparison of serum oxidative stress products between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

表2 急性脑梗死组中miR-497-5p 低表达与高表达患者血清氧化应激产物的比较（±s）Table 2 Comparison of serum oxidative stress products between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

miR-497-5p表达高表达低表达t 值P 值n 66 66 MDA(μmol/L)12.58±3.62 10.77±3.11 3.081 0.003 AOPP(μmol/L)69.39±13.27 62.37±10.25 3.401 0.001 8-OHdG(ng/mL)0.84±0.20 0.73±0.16 3.490 0.001

2.4 急性脑梗死组中90 d 预后良好与预后不良患者miR-497-5p 表达水平的比较

急性脑梗死组中90 d 预后良好患者外周血中miR-497-5p 的表达水平与预后不良患者比较明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 急性脑梗死组中90 d 预后良好与预后不良患者miR-497-5p 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of miR-497-5p expression levels between patients with good and poor 90 day prognosis in acute cerebral infarction group（±s）

表3 急性脑梗死组中90 d 预后良好与预后不良患者miR-497-5p 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of miR-497-5p expression levels between patients with good and poor 90 day prognosis in acute cerebral infarction group（±s）

90 d 预后预后良好预后不良t 值P 值n 75 57 miR-497-5p 1.06±0.26 1.61±0.40 9.551 0.000

2.5 miR-497-5p 预测急性脑梗死患者90 d 预后的ROC 曲线分析

外周血miR-497-5p 表达水平预测急性脑梗死患者90 d 预后的ROC 曲线见图1，AUC 为0.893，95%CI为：0.834～0.951。根据约登指数最大值确定外周血miR-497-5p 表达水平预测急性脑梗死患者90 d 预后的最佳截断值为1.136，该截断值预测预后的灵敏度为86.67%、特异性为80.70%。见图1。

图1 miR-497-5p预测急性脑梗死患者90 d预后的ROC曲线Figure 1 ROC curve of miR-497-5p in predicting 90 day prognosis of patients with acute cerebral infarction

3 讨论

急性脑梗死的发病涉及复杂的病理生理机制，颅内动脉血栓栓塞或血栓形成后脑组织发生缺血缺氧损害是基本的病理生理特征，在缺血缺氧基础上发生的炎症反应和氧化应激反应是造成神经功能继发性损害的重要因素，神经功能持续发生损害导致疾病的治疗难度增加、致残率升高［5-7］。因此，研究在急性脑梗死发病过程中炎症反应及氧化应激的关键调控分子不仅有助于发现疾病新的治疗靶点，也有助于发现病情早期评估及预测的标志物。

本研究以miR-497-5p 为切入点进行了急性脑梗死炎症反应、氧化应激反应及预后的评估。MiR-497-5p 是近些年受到越来越多关注的一种miR。Chen X［3］的动物实验证实，大脑中动脉闭塞大鼠的缺血脑组织中miR-497-5p 的表达水平增加，抑制miR-497-5p 的表达具有神经保护作用；闫海清［8］的细胞实验证实，缺氧复氧的神经元中miR-497-5p 的表达水平增加，抑制miR-497-5p 的表达明显改善缺氧复氧诱导的神经元凋亡。以上动物及细胞实验提示缺血缺氧能够刺激miR-497-5p表达增加，高表达的miR-497-5p 又介导了神经损害。在此基础上，本研究分析发现急性脑梗死患者外周血中miR-497-5p 的表达水平高于对照组，表明急性脑梗死发病过程中存在miR-497-5p 的异常高表达，与既往动物实验和细胞实验中关于miR-497-5p表达变化的报道一致。

MiR 虽然具备编码功能，但能通过调控下游靶基因表达的方式发挥相应的生物学效应。在急性脑梗死的发病过程中，多种miR 靶向调控炎症反应和氧化应激反应［9-10］。根据闫海清的细胞，miR-497-5p 在缺氧复氧的神经元中靶向抑制AKT3 的表达，进而使炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及氧自由基释放增多，氧自由基可引起脂质、蛋白质、核酸发生过氧化并生成MDA、AOPP、8-OHdG［8］。已有研究报道，急性脑梗死患者血清中炎症因子及氧化应激产物的含量明显增加［11-14］。本研究分析了miR-497-5p 表达与炎症因子及氧化应激产物的关系，随着急性脑梗死患者外周血miR-497-5p表达水平的增加，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、AOPP、8-OHdG 的含量也呈升高趋势，表明急性脑梗死发病过程中miR-497-5p 的异常高表达对炎症反应及氧化应激反应具有促进作用。

炎症反应和氧化应激反应在急性脑梗死发生后的病情转归中起重要作用，多项研究证实炎症及氧化应激指标对急性脑梗死的预后具有评估价值［15-18］。本研究已经证实急性脑梗死患者miR-497-5p与炎症反应、氧化应激反应的关系，进一步随访患者90d 预后并分析其与miR-497-5p 的关系可知：预后良好患者的外周血miR-497-5p 表达水平低于预后不良患者且miR-497-5p 对90d 预后具有预测价值，表明急性脑梗死发病后miR-497-5p 的异常高表达与预后不良有关。

综上所述，急性脑梗死患者外周血miR-497-5p的异常高表达与炎症因子、氧化应激产物释放增多及90 d 预后不良有关，未来miR-497-5p 有望成为研究急性脑梗死发病机制及治疗靶点的目标分子，也可作为急性脑梗死病情及预后评估的标志物。