PTEN、uPA和EZH2表达对胃癌术后复发预测

胡楠 汤佳琦 张竞舟 周康杰 吴学雨 洪义东 吴风雷

胃癌是一种起源于胃壁表层黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率位居恶性肿瘤第2 位，死亡率较高［1］。国内外文献均有报道，可通过CA125、CEA 等血清肿瘤标志物检测部分胃癌患者术后是否发生复发、转移，但这些标志物对胃癌术后复发监测特异性不高，诊断率不理想［2］。近年来，有学者报道抑癌基因磷脂酶和张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）表达会促进肿瘤的发生发展［3］。已有相关研究报道，胃癌组织中尿激酶型纤溶酶原激活物（Urokinase-type plasminogen activator，uPA）阳性表达率较高［4］，但其与胃癌术后复发的关系研究较少。本研究旨在探讨PTEN、uPA、EZH2在胃癌患者中的表达情况，并分析联合三者检测对胃癌术后复发的预测价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月至2019年1月本院接受胃癌根治术治疗的80 例胃癌患者（80 份胃癌组织标本）作为胃癌组。其中男59 例，女21 例；平均年龄（63.44±5.78）岁；肿瘤位于胃底贲门者33 例，胃体者27 例，胃窦者20 例。选取上述患者远离肿瘤3 cm 的癌旁正常组织作为癌旁组织组。

纳入标准：①所有患者均经影像学检查及术后病理检查确诊为胃癌［5］；②符合胃癌根治术的手术指征；③未合并凝血功能障碍；④未合并严重的心、肺等重要器官功能障碍；⑤临床资料完整；⑥所有患者均已签署知情同意书，研究通过医院医学伦理委员会批准。排除标准：①合并其他系统恶性肿瘤；②合并肠道息肉、感染性肠道疾病；③治疗依从性不佳；④随访资料不全者。

1.2 方法

1.2.1 PTEN、uPA、EZH2检测方法

采用免疫组化染色法检测PTEN、uPA、EZH2表达情况。每例组织蜡块均切片4 张，厚度约4 μm。PTEN、uPA、EZH2标本均经甲醛溶液固定，石蜡包埋、载玻片泡酸、高温灭菌及多聚赖氨酸涂片等处理。DAB 显色剂显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。操作步骤严格按照试剂说明书进行。PTEN、uPA、EZH2兔多克隆抗体均采购自美国Epitomics 公司。DAB 显色剂及配套试剂盒采购自北京中杉金桥生物技术有限公司。L.3 回旋式切片机由北京手术器械厂提供。

1.2.2 判定标准

3 位病理科医师在光学显微镜下随机观察5个视野，要求每个视野至少计数100 个完整的肿瘤细胞。PTEN、uPA、EZH2免疫组化阳性判定标准［6］：肿瘤细胞胞质或细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒，反之则为阴性。阳性细胞比例评分：0、1、2、3、4 分；染色强度评分：未染色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。染色指数=阳性细胞比例评分＋染色强度评分。染色指数＞3 分为阳性；染色指数≤3 分为阴性。阳性率=阳性例数/总例数×100%。

1.3 随访

对80 例胃癌患者进行为期2年的随访，了解患者胃癌复发情况。随访开始时间为患者进行胃癌根治术后，随访截止时间为2021年1月。随访平均随访时间（15.11±2.87）个月。随访方式：来院复查及电话随访。胃癌复发标准［7］：术后2 个月，复查腹部CT，提示腔内肿块/溃疡，可见环提征，胃腔狭窄等影像征象，腹部增强CT 提示胃壁异常强化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以（）表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；通过Logistic 回归模型分析影响胃癌复发的非条件单因素和多因素；绘制ROC 曲线，计算曲线下面积（AUC），以分析不同PTEN、uPA、EZH2表达鉴别诊断胃癌复发的相对应灵敏度、特异度，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中PTEN、uPA、EZH2 水平比较

胃癌组PTEN 阴性表达率显著高于癌旁组织组，uPA 及EZH2阳性表达率显著高于癌旁组织组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 不同组织中PTEN、uPA、EZH2 水平比较［n（%）］Table 1 Comparison of PTEN，uPA and EZH2 levels in different tissues［n（%）］

图1 胃癌组织中PTEN、uPA、EZH2 免疫组化染色图（SP，× 500）Figure 1 immunohistochemical staining of PTEN，uPA and EZH2 in gastric cancer（SP，× 500）

2.2 胃癌组织中不同PTEN、uPA、EZH2 表达的患者术后复发情况

80 例胃癌患者随访期间内有17 例患者死亡，死亡率为21.25%。80 例患者中复发率为26.25（21/80）。PTEN 阴性、uPA 阳性及EZH2阳性的患者术后复发率明显高于PTEN 阳性、uPA 阴性及EZH2阴性的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 胃癌组织中不同PTEN、uPA、EZH2 表达的患者术后复发情况［n（%）］Table 2 recurrence of gastric cancer patients with different expression of PTEN，uPA and EZH2［n（%）］

2.3 胃癌患者术后复发的影响因素分析

浸润深度T4、有盆结节、PTEN 阴性、uPA 阳性、EZH2阳性为影响胃癌患者术后复发的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 胃癌患者术后复发的影响因素分析Table 3 Analysis of influencing factors of postoperative recurrence in patients with gastric cancer

2.4 PTEN、uPA、EZH2 及三者联合检测对胃癌患者术后复发的预测价值

PTEN、uPA、EZH2及三者联合检测AUC 分别为0.552、0.675、0.672、0.899，各指标AUC 以联合检测最大，三者联合检测灵敏度、特异度显著高于PTEN、uPA、EZH2单一检测（P＜0.05）。见表4及图2。

图2 PTEN、uPA、EZH2 及三者联合检测对胃癌患者术后复发的预测价值Figure 2 predictive value of PTEN，uPA，EZH2 and their combined detection for postoperative recurrence of gastric cancer

表4 PTEN、uPA、EZH2 及三者联合检测对胃癌患者术后复发的预测价值Table 4 predictive value of PTEN，uPA，EZH2 and their combined detection for postoperative recurrence of gastric cancer

3 讨论

胃癌发病机制尚不明确，但有学者研究发现该病的发生与地域环境、患者饮食习惯、幽门螺杆菌感染、癌前病变及遗传因素密切相关［8］。早期胃癌患者可通过根治手术治疗切除病灶，据相关研究统计，有50%～80%的患者术后仍面临复发、转移的风险［9］。可见，对于胃癌患者根治术后加强监测高灵敏度、高特异度的肿瘤标志物，对评估患者预后意义重大。

PTEN基因是近年来发现的一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有负性调控PI3K/AKT 通路，抑制丝裂原活化的蛋白激酶通路的作用［10］。已有较多文献报道，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中均存在PTEN基因缺失，因此认为PTEN基因与恶性肿瘤发生、发展密切相关［11］。本研究中胃癌组织中PTEN 阳性表达率明显低于癌旁正常组织中的阳性表达率，PTEN阴性表达的胃癌患者术后复发风险明显高于PTEN 阳性表达的患者，进一步证实上述观点。

uPA 是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，可将纤溶酶原激活呈纤溶酶，纤溶酶可降解纤维蛋白、层粘连蛋白，促进肿瘤侵袭、转移［12］。已有相关研究报道，uPA 与血管内皮因子之间有着显著相关性，且uPA 可为血管生成提供有利条件，影响细胞生长、分化及凋亡［13］。Haghighi 等学者［14］通过动物实验发现，uPA 抗体具有较强的阻断癌细胞侵袭的能力，证实uPA 在恶性肿瘤侵袭、转移中的作用。本研究中，uPA 阳性表达的胃癌患者术后复发率为80.65%，与Lee 等学者［15］报道结果大致相同。

EZH2与细胞生长调节相关，通过抑制染色质中的靶基因而调节细胞增殖。作为转录阻遏因子，EZH2控制细胞的记忆系统，能够促进细胞增殖、肿瘤细胞扩散，在多种肿瘤组织中高表达，已成为近年来研究焦点。本研究结果与国外学者报道结果相一致［16］。分析胃癌组织中EZH2阳性表达率较高的原因：可能为EZH2参与细胞周期的调控，导致胃粘膜上皮细胞周期异常，癌细胞增殖速度加快，导致胃癌患者术后复发。本研究通过绘制ROC 曲线提示联合三者检测比单一检测更具预后判断价值。

综上，胃癌的发展、侵袭、转移及术后复发是一个由多种基因、蛋白参与的过程，需在胃癌根治术患者术后加强PTEN、uPA、EZH2三者联合检测，有利于临床综合判断患者术后预后情况，对指导临床治疗具有重要意义。