基于HPLC法的‘迷你红柚’果实中类胡萝卜素组成分析

吴英详 黄成能 龚江美 黄建英 潘腾飞x

摘  要：为研究‘迷你红柚果实发育过程中的类胡萝卜素组分与含量变化，本研究采用正乙烷-无水乙醇-丙酮（2∶1∶1）萃取法对‘迷你红柚果实中的类胡萝卜素进行快速提取，利用高效液相色谱（HPLC）测定了果实海绵层、囊衣和汁胞及其不同发育时期的类胡萝卜素组分和含量。结果表明，流动相为乙腈-甲醇-四氢呋喃（90∶5∶5），流速0.3 mL/min，进样量10 μL，柱温40 ℃，样品室温度20 ℃，检测波长450 nm，3种类胡萝卜素8 min内即可较好地分离;‘迷你红柚成熟果实中含有3种类胡萝卜素，含量从高到低依次是番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素;类胡萝卜素主要积累在汁胞中，番茄红素是红色的汁胞、囊衣和海绵层中最重要的色素;随着果实的发育成熟，类胡萝卜素的含量逐渐升高，番茄红素和β-胡萝卜素在汁胞和囊衣中随着果实的发育而累积，玉米黄素只在成熟阶段的果实中检测到，且含量显著低于番茄红素和β-胡萝卜素。研究结果为‘迷你红柚果实品质评价和开发利用提供科学依据。

关键词：柚;番茄红素;β-胡萝卜素;玉米黄素

Abstract： To determine the components and contents of carotenoid in ‘Minihongyou [Citrus maxima （Burm.） Merr.]， a putative new pomelo mutant， the solvent extraction method was used to quickly extract the carotenoids from the fruits， the components and contents of the carotenoids in albedo， segment wall and juice sacs during the developmental stages weredetermined by UPLC technology. The results showed that the optimum extractant was N-ethane， anhydrous ethanol andacetone with a proportion 2∶1∶1. The mobile phase of UPLC was acetonitrile-methanol-tetrahydrofuran （90∶5∶5）， flow rate was 0.3 mL/min， injection volume was 10 μL， column temperature was 40 ℃， sample temperature was 20 ℃.Carotenoids could be separated exactly at 450 nm for 8 min. As determined by UPLC， three major types of carotenoids were contained in mature fruits， the content of which were lycopene， β-carotene， and zeaxanthin in order from high to low. Carotenoids were mainly accumulated in juice sacs， and lycopene was the most important pigment in juice sacs， segment wall and albedo. Accompanied by fruit development， the content of carotenoids gradually increased. Lycopene and β-carotene accumulated in the juice sacs and segment with the fruit development. Zeaxanthin was only detected in mature fruits， and the content was significantly lower than lycopene and β-carotene.

Keywords： pomelo; lycopene; β-carotene; zeaxanthin

色澤是果实感官品质的重要指标，对果实及其后续生产加工具有重要的影响，色素的积累是果实色泽形成的基础，色素的种类、含量决定了果实的色质和呈色深度[1]。类胡萝卜素在园艺产品中分布广泛，吸光能力强，在400～500 nm内具强吸收，能呈现出红色、橙色以及黄色[2]。类胡萝卜素由于具有多个共轭双键，具有抗氧化、预防慢性疾病、抗癌和增强抵抗力等功效，对人体具有一定的保健功能。

类胡萝卜素具有亲脂性，不同结构的类胡萝卜素所用的提取溶剂差异较大[3]，传统的提取方法常用组合溶剂提高提取效率[4]。目前，酶辅助提取[5]、微波辅助提取[6]、超声波辅助提取[7]和超临界流体萃取[8]等提取技术也被广泛应用。类胡萝卜素的检测方法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）[9]、超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）[10]和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatograph-mass spectrometer /mass spectrometer，LC-MS /MS）[11]，其中，UPLC是最常用的方法，具有价廉、易操作和稳定性好等优点，是分析果实类胡萝卜素的有效工具。

柚[Citrus maxima （Burm.） Merr.]含有丰富的类胡萝卜素。研究发现，成熟时期的红色蜜柚果实中含有丰富的类胡萝卜素，红肉的‘琯溪蜜柚突变体以番茄红素为主要呈色色素，‘三元红心柚的海绵层和果肉的红色也是因积累番茄红素而着色[12]，‘红绵蜜柚和‘三红蜜柚的外果皮、海绵层、囊衣等组织因含有番茄红素与β-胡萝卜素而显红色，且不同类型的蜜柚类胡萝卜素的含量存在明显差异[13]。类胡萝卜素在果实发育过程中的积累呈现动态变化，种类和含量差异很大[14-15]。对‘红肉蜜柚等红肉品种的蜜柚果实不同发育时期类胡萝卜素的积累过程研究发现，外果皮类胡萝卜素的积累机制与海绵层、囊衣和汁胞不同[13]，类胡萝卜素合成途径基因的表达量在各组织中存在差异[16]，但柚果实中类胡萝卜素的积累机制还有待进一步研究。

‘迷你红柚是一个疑似从‘琯溪蜜柚芽变产生的新种质[17]，其果形较小，具有海绵层薄、无籽、不粒化等优点，与‘琯溪蜜柚相比，其果肉呈红色，外果皮和海绵层呈淡红色，但其主要色素组分尚不明确。为确定‘迷你红柚果实所含类胡萝卜素主要组分和含量及其在不同组织和不同发育时期的积累规律，本研究采用UPLC技术检测了‘迷你红柚汁胞、囊衣、海绵层类胡萝卜素的成分与含量，探究其显色规律和累积变化，为‘迷你红柚的果实品质评价和开发利用提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  ‘迷你红柚果实采自福建省平和县，从花后150 d开始取样，此后每隔30 d取样1次，直至果实完全成熟，共取样5次。每次取样选择大小、成熟度相近的果实，3个果实为1个重复，每组样品3个重复。采收后立即取出海绵、囊衣、汁胞，用锡箔纸包装后，液氮速冻，置于–80 ℃冰箱中保存。

番茄红素标准品、β-胡萝卜素标准品、玉米黄素标准品以及丁羟甲苯（BHT），美国Sigma公司;四氢呋喃（色谱纯），购自上海Macklin公司;甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），购自德国Merck公司;石油醚、丙酮、正乙烷、甲醇、无水乙醇、二氯甲烷等均为分析純，购自上海沪式实验室器材股份有限公司;超纯水为自制。

1.1.2  仪器与设备  主要仪器设备包括ACQUITY UPLC?（美国 WATERS 公司）超高效液相色谱仪，配有自动进样器、四元溶剂管理器、C18色谱柱（ACQUITY-X Bridge BEH，2.1 mm× 100 mm，1.7 ?m），ACQ-TUV紫外检测器（ACQUITY UPLC H-Class系统）、和WATERS? EMPOVER 3分析软件;Allegra 64R高速冷冻离心机（美国Backman公司）;旋转蒸发仪（日本Eyela公司）等。

1.2  方法

1.2.1  类胡萝卜素的提取  参照龚江美[18]的方法提取类胡萝卜素。将样品在液氮下迅速研磨成粉末，转移入50 mL离心管中，加入10 mL预冷提取剂;恒温水浴锅40 ℃下振荡浸提30 min;4 ℃下12000 r/min离心15 min;取上清液于50 mL离心管;重复3次，合并上层有机相，得到样液。将样液转移至分液漏斗中，用双蒸水洗涤3～4次至中性、洁净无渣，加入少量无水硫酸钠脱水;转移至蒸馏烧瓶，在旋转蒸发仪中200 MPa、35 ℃条件下蒸干;加入2 mL二氯甲烷充分溶解，转移至2 mL离心管中，低温避光保存。所有样品进样前经0.22 μm微孔滤膜过滤。

提取剂采用以下5种：石油醚-丙酮（1∶1）、石油醚-丙酮（2∶1）、正乙烷-丙酮（2∶1）、正乙烷-甲醇-丙酮（2∶1∶1）、正乙烷-无水乙醇-丙酮（2∶1∶1）。

1.2.2  色谱条件  流速0.3 mL/min;进样量10 μL;柱温40 ℃;样品温度20 ℃;检测波长450 nm;流动相为乙腈-甲醇-四氢呋喃（90∶5∶5），等度洗脱。

1.2.3  标准曲线的制作  精密称取番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素标准品各1.0 mg，溶于二氯甲烷中，定容为100 μg/mL的标准母液。 逐级稀释，制成0.77、1.53、3.06、6.12、12.5、25、50、100 μg/mL标准溶液进样经UPLC测定。以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），制作标准曲线。

1.2.4  精密度、重复性和回收率试验  取番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素标准品母液，重复进样10次，分别记录保留时间和峰面积，计算出平均值、标准差和变异系数，评价仪器的精密度和方法的重复性。

取‘迷你红柚样液3份，测定其色素含量;参考陈银花等[19]的方法，分别加入70 μg番茄红素标准品、70 μg β-胡萝卜素标准品、80 μg玉米黄素标准品进行测定，计算回收率，平行测定3次。

1.2.5  样品类胡萝卜素的测定  利用ACQUITY UPLC?超高效液相色谱仪，按上述筛选后的方法进行上样测定，记录色谱图峰面积，代入标准曲线，计算出类胡萝卜素含量。计算公式如下：

类胡萝卜素物质含量（mg/g）=（C×V）/M

其中，C为标准曲线算得的样品浓度（mg/mL）;V为样品定容体积（mL）;M为样品称样量（g）。

1.3  数据处理

利用SPSS 19.0软件对数据进行处理，采用S-N-K法进行差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  不同提取剂对‘迷你红柚果实类胡萝卜素的提取差异

比较5种提取剂对‘迷你红柚果实（花后180 d）中类胡萝卜素的提取效果，结果如图1、图2所示。正乙烷-无水乙醇-丙酮（2∶1∶1）的提取效果最佳，在相同的色谱条件下，各相邻色谱峰分离较好，所提取得到的类胡萝卜素（420 ?g/g）显著高于其他提取剂，其次为正乙烷-甲醇-丙酮（2∶1∶1）（350 ?g/g），石油醚-丙酮（1∶1，2∶1）和正乙烷-丙酮（2∶1）的提取效果较差，本研究选择正乙烷-无水乙醇-丙酮（2∶1∶1）作为柚果实类胡萝卜素的提取剂。

2.2  标准曲线、重复性、精密度和回收率分析

番茄红素、β-胡萝卜素与玉米黄素的线性相关系数依次为0.9985、0.9990、0.9987，线性回归方程分别为：y=22693x–27915，y=24512x–29459，y=29837x–34619。由表1可知，番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素标准品保留时间的变异系数分别为0.25%、0.30%、0.21%，重复性良好。峰面积的变异系数分别为0.69%、1.00%、0.41%，仪器精密度良好。本研究建立的UPLC测定方法较为准确，可用于检测果实类胡萝卜素含量。

将检测总量减去样液原测出量，再除以加标量，得到回收率，结果如表1所示，3种类胡萝卜素的平均回收率分别为98.6%、102.3%、99.1%，说明该本测定方法准确度较高。

2.3  成熟果实中的类胡萝卜素组分及含量分析

‘迷你红柚的成熟果实如图3所示，汁胞红色，囊衣粉红色，海绵层淡粉色。UPLC的测定结果表明，果实中含有番茄红素、β-胡萝卜素和与米黄素。在成熟果实不同组织中，类胡萝卜素含量差异显著（表2）。汁胞中的类胡萝卜素含量最高，达461.10 μg/g，显著高于囊衣中所含的122.81 μg/g，海绵层中所含的类胡萝卜素最少，仅有51.49 μg/g。汁胞中番茄红素含量为387.65 μg/g，占汁胞中所含类胡萝卜素的84.07%，是主要的成色色素，β-胡萝卜素含量为66.79 μg/g，占14.48%，玉米黄素含量6.66 μg/g;在囊衣中，含量最高的亦是番茄红素，占囊衣中类胡萝卜素含量的61.34%，β-胡萝卜素占33.12%，玉米黃素占5.53%;海绵层中主要含有番茄红素和β-胡萝卜素。

2.4  果实发育过程中的胡萝卜素组分与含量分析

在果实发育期间，不同类胡萝卜素组分在果实不同组织中的积累和变化趋势如图4所示。结果表明，番茄红素和β-胡萝卜素在汁胞和囊衣中随着果实的发育而累积，玉米黄素只在成熟阶段的果实中检测到，且含量显著低于番茄红素和β-胡萝卜素。在果实发育早期，汁胞中就含有大量的番茄红素，从花后180 d至果实成熟，番茄红素的含量无显著差异（P=0.67>0.05），说明汁胞中的番茄红素主要是在果实发育的早期积累，这与观察结果相一致，即在果实发育的早期汁胞即表现出红色;而β-胡萝卜素则随着果实的发育而显著增加，玉米黄素只在成熟果实中积累。囊衣中的番茄红素含量呈先上升后下降的趋势，β-胡萝卜素含量在果实发育过程中呈现显著上升的变化趋势，与汁胞相同，只在成熟果实的囊衣中检测到玉米黄素。海绵层中的番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素的变化趋势与囊衣的变化趋势一致，但3种组分的含量在各个发育时期均低于囊衣和汁胞。

3  讨论

由于类胡萝卜素种类繁多，结构也不尽相同，且广泛存在于各种果蔬中，目前并无一种溶剂或混合试剂可广泛应用于各种材料、各种类胡萝卜素的提取。极性大的含氧类胡萝卜素主要使用丙酮等极性强的溶剂，极性小的主要使用石油醚等极性弱的溶剂[20]。孙丹等[21]在用HPLC-MS/MS法测定甜樱桃花色苷与非花色苷酚时，用甲酸–甲醇提取花色苷，用乙酸乙酯提取非花色苷酚;赵文恩等[22]在测定苹果果皮的类胡萝卜素时以丙酮与石油醚为提取剂。柚果实中类胡萝卜素的提取方法较多，针对不同类型的柚品种和组织有不同的提取试剂，邵金华等[23]用丙酮作为萃取剂提取柚皮中的类胡萝卜素，陶俊等[24]用含有1% BHT的丙酮溶液提取柑橘果实的类胡萝卜素，而乙醇-丙酮（1∶1）适于提取柑橘叶片中的类胡萝卜素[25]，本试验在前人研究的基础上，通过比较确定了正乙烷-无水乙醇-丙酮（2∶1∶1）是提取‘迷你红柚果实类胡萝卜素的最适宜提取剂，这与陈细羽等[10]的研究结果一致，说明‘迷你红柚果实中的类胡萝卜素为极性较大的含氧类胡萝卜素。

柑橘类果实的呈色色素包括类胡萝卜素和花青素[24]，柑橘果实中的类胡萝卜素有115种[26]，果实中主要积累叶黄素，包括玉米黄素，β-隐黄质等[27-28]。在目前所发现的柚资源中，仅有紫皮柚的果皮含有花青苷，而其他资源都是积累类胡萝卜素而呈色[29]，红色汁胞主要是因为含有较高含量的番茄红素、β-胡萝卜素或β-隐黄质而呈色[14]，因此本研究只检测‘迷你红柚果实中的番茄红素等类胡萝卜素组分。不同类型的柑橘果实积累的类胡萝卜素种类不同，比如宫内伊予柑果皮中以玉米黄素、β-隐黄质2种色素为主，β-胡萝卜素含量不足类胡萝卜素的 1%，α-胡萝卜素极低[30-31]，在柚果实中，主要是由于β-胡萝卜素、八氢番茄红素和番茄红素等类胡萝卜素的积累而使果实呈现红色[32]。在‘三红蜜柚和‘红肉蜜柚成熟果实中含有大量的番茄红素[13]，本研究发现，‘迷你红柚汁胞中含量最高的类胡萝卜素为番茄红素，这与柚果实红色芽变品种的呈色色素一致，说明番茄红素也是‘迷你红柚的主要呈色色素。在葡萄柚果实中，主要的色素成分为β-胡萝卜素[33]，而宽皮柑橘果实中的主要类胡萝卜素是β-隐黄质，但是在‘迷你红柚中，β-胡萝卜素的含量低于番茄红素，没有检测到β-隐黄质，表明‘迷你红柚果实β-胡萝卜素的代谢途径与葡萄柚和宽皮柑橘有较大差异。在‘红肉蜜柚汁胞中含有叶黄素[13]，果肉呈黄色的‘黄金蜜柚汁胞中含有β-隐黄质，但未检测出玉米黄素[32]，葡萄柚果实中只含有约0.50 μg/g的玉米黄素[33]，本研究发现‘迷你红柚中含有玉米黄素，但含量低于其他类型的类胡萝卜素，这与前人的研究结果一致。

果实不同组织中积累的色素组分不同。果皮是类胡萝卜素积累的主要部位，通常果皮比果肉类胡萝卜素含量高 2.5～15倍[34]。在‘紅肉蜜柚果实中，汁胞和囊衣中的番茄红素无显著差异，但在‘三红蜜柚中，囊衣中的番茄红素含量是汁胞中的2倍左右[13]，在‘迷你红柚中，番茄红素只要集中在汁胞，这与形态学观察结果一致，但番茄红素在不同组织中如何形成和运输还有待进一步研究。在柚果实发育过程中，类胡萝卜素的含量随着果实的发育逐渐增加[13]，在本研究中也发现，汁胞、囊衣中的类胡萝卜素含量随着果实的发育逐渐增加，但玉米黄素只在成熟果实中出现。在类胡萝卜素的代谢途径中，番茄红素是第一个合成的有色类胡萝卜素物质，番茄红素在β-环化酶的催化下进一步生成β-胡萝卜素，然后在羟化酶的作用下生成玉米黄素[35-36]，在‘迷你红柚的成熟果实中，可能存在着类似的类胡萝卜素合成途径，导致有部分玉米黄素生成，且是在囊衣中首先出现，推测玉米黄素的合成首先在囊衣中进行，但累积的色素是在果实内部合成或是果实外部合成后转运至果实中，还有待进一步研究。

综上所述，‘迷你红柚果实所含类胡萝卜素类组分和积累规律与‘红肉蜜柚等柚果实相似，类胡萝卜素的合成和积累受特定的细胞器官、发育时期等因素共同调控。本研究明确了‘迷你红柚果实的色素组分，对柚类果实的类胡萝卜素代谢机制研究具有重要意义，也为其果实品质的评价提供了理论依据，有助于该品种的推广应用。

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责任编辑：崔丽虹