飞机草提取物的体外与体内抗菌作用研究

杨航 黄凌 吕传柱

自1928年人类发现青霉素到1943年正式投入临床使用，人类开始不断发现或合成新型抗生素，而微生物也在不断进化从而出现耐药，进而导致抗生素的杀伤力减弱。据统计，2000～2015年全球抗生素的消耗量增长了近65%[1]，而研究表明每年全世界约有70万例患者因抗生素耐药死亡[2]。在我国，感染是造成40岁以上人群第5大死亡原因[3]，因此新型抗菌药物的研发亟不可待。由于天然植物来源广泛，毒副作用小，抗菌谱广，目前已经有越来越多的科学家把目光投向了天然植物，以找出合适的抗菌药物衍生物[4～6]。飞机草在我国、印度、喀麦隆、越南、泰国等发展中国家常被作为传统药物使用，主要应用于止血、抗炎、促进伤口愈合、抗感染等[7～9]。有研究表明飞机草叶的水及乙醇提取物对真菌具有一定的抗菌活性，且呈浓度依赖性[10]，也有研究表明飞机草叶提取出的脂溶性物质对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌也具有抗菌活性[11]，以上研究均表明飞机草提取物具有体外抗菌作用，有望成为新型抗菌药物研究的对象。本实验通过飞机草叶、茎、全草3个部位的提取物针对常见致病菌进行体外、体内抗菌作用研究，为飞机草作为新型抗菌药物的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂2019年7月于海口采集飞机草，经海南医学院药理学院张小坡教授鉴定为菊科泽兰属飞机草。试剂：无水甲醇（上海化科公司）；95%乙醇（佛山予华仪器科技有限公司）；无水丙酮（天津市富宇精细化工有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；羧甲基纤维素钠（CMCNa，上海Aladdin公司）；MH琼脂培养基（青岛hopebio公司）；营养肉汤培养基（广东环凯公司）；无菌脱纤维绵羊血（南京乐诊生物技术有限公司）；注射用青霉素钠（广州白云山天心制药公司）。

1.2 实验菌株与动物金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 25923、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）ATCC49619、大肠埃希菌（E. Coli） ATCC25922、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa） ATCC27853，以上4种菌种均来自海南医学院第一附属医院检验科。金黄色葡萄球菌（S. aureus） CMCC26001来自中国食品药品检定研究院。健康昆明种小鼠150只，SPF级，雌雄各半，体重18～20g，购自海南药物研究所。

1.3 方法

1.3.1 飞机草各部位提取液制备 将采集的飞机草置于阴凉处阴干，将部分飞机草叶、茎分离，用碾碎机碾碎，各部位再分别用甲醇、95%乙醇、丙酮、水浸泡48h，过滤，重复2次，合并滤过液，用旋转蒸发仪蒸发、浓缩，最后将飞机草各组分浓缩液置于恒温蒸发仪上再次除去多余的溶剂得到不同溶剂浸膏。体外抗菌实验中，用DMSO溶解各组分浸膏，配制成浓度为128mg/ml的溶液，用0.22m的过滤器对溶液进行过滤消毒。同时配制浓度为128mg/ml青霉素溶液，设为阳性对照组，无菌的DMSO溶液为阴性对照组。体内抗菌实验中，根据课题组前期急性毒性结果及体外抗菌结果，以配制的飞机草提取物的浓度不致小鼠死亡作为体内抗菌的给药浓度，用1%的羧甲基纤维素钠溶液分别配制飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、叶水提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草乙醇提取物菌悬液，浓度分别为0.8g/ml、1.2g/ml、0.6g/ml、1.8g/ml、1.0g/ml、0.3g/ml、1.0g/ml。青霉素溶液作为阳性对照组，配成0.1g/ml；1%的羧甲基纤维素钠溶液为模型组；正常喂养小鼠为阴性对照组。

1.3.2 菌液制备

1.3.2.1 体外抗菌菌液制备 配制在波长为600nm处吸光度为0.5时的菌液，通过平板计数法[12]，得出各菌种吸光度在0.5时的菌液浓度为（1.5～3.0）×108CFU/ml。

1.3.2.2 体内抗菌菌液制备 同样采用平板计数法，计算每毫升金黄色葡萄球菌 ATCC25923的菌液浓度。通过腹腔注射菌液建立感染模型，计算最小致死菌液浓度为4×108CFU/ml。

1.3.3 体外抗菌实验

1.3.3.1 飞机草提取物抑菌圈直径测定 采用纸片扩散法进行抑菌圈直径测定，取配制好的菌悬液150μl，涂布均匀，晾干后在琼脂板上放置无菌药敏纸片（直径6mm，厚度1mm），取配制的飞机草各部位提取物溶液、青霉素及DMSO溶液15μl滴在药敏纸片上，重复3次，做好标记，将平板倒扣在培养箱中培养18h后，测量各提取物抑菌圈直径。

1.3.3.2 飞机草提取物最小抑菌浓度（MIC）测定 采用微量肉汤稀释法，分组如下：①飞机草各部位提取物作为实验组，加药加菌；②青霉素为阳性对照组，加药加菌；③菌液组，加菌液不加药；④空白对照组，仅加细菌培养基。检查结果通过肉眼观察实验组各孔的澄清度，以刚好未出现浑浊的浓度作为该组药物MIC，如果难以确定的孔，可选波长在492nm处吸光度为0.4的飞机草提取物的孔进行再次实验。

1.3.4 体内抗菌实验 小鼠随机分组，雌雄各半，每组10只。除空白对照组，每组小鼠腹腔注射浓度为4×108CFU/ml的金黄色葡萄球菌 ATCC25923菌液0.4ml。根据体外抗菌结果，选择飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、叶水提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草乙醇提取物进行灌胃给药，按每只小鼠以0.2ml/10g给药，每天1次，连续灌胃3d，记录7d内每组小鼠的存活率。及时对死亡的小鼠进行解剖，观察体内脏器的变化，同时留取肝、肺、肾的病理标本，进行HE染色，做病理检测。1周后，对每组存活的小鼠采取摘取眼球取血的方式，检测WBC及NEUT%水平。

1.4 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行分析及作图，多组间比较采用单因素方差分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑菌圈直径测定飞机草各部位提取物对5种细菌的抑菌圈直径见表1。飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、叶水提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草乙醇提取物对金黄色葡萄球菌ATCC25923具有一定抑菌作用，其抑菌圈直径分别为11mm、11mm、11.5mm、10mm、12mm、12.5mm、11mm；且上述提取物对金黄色葡萄球菌CMCC26001同样具有一定抑菌作用，其抑菌圈直径分别为12mm、11mm、12mm、11mm、8mm、13mm、10mm，而茎甲醇提取物、茎水提取物、全草甲醇提取物、全草丙酮提取物、全草水提取物对金黄色葡萄球菌ATCC25923与金黄色葡萄球菌 CMCC26001无明显抑菌效果。见图1、2。除飞机草叶、茎、全草水提取物对肺炎链球菌 ATCC49619无明显抑菌作用，飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、茎甲醇提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草甲醇提取物、全草乙醇提取物、全草丙酮提取物对肺炎链球菌 ATCC49619均具有不同程度的抑菌作用，其抑菌圈直径分别为11mm、11.5mm、11mm、11mm、12mm、12mm、12.5mm、13mm、12mm，见图3。仅飞机草叶水提取物对大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌 ATCC27853具有抑菌作用，其抑菌圈平均直径分别为7.5mm与9mm，其它飞机草提取物对这两种细菌均无抑菌作用，见图4、5。

表1 飞机草各部位提取物对5种细菌的抑菌圈直径（mm）

图1 飞机草各部位提取物对金黄色葡萄球菌 ATCC25923的抑菌作用

图2 飞机草各部位提取物对金黄色葡萄球菌 CMCC26001的抑菌作用

图3 飞机草各部位提取物对肺炎链球菌 ATCC49619的抑菌作用

图4 飞机草各部位提取物对大肠埃希菌ATCC25922的抑菌作用

图5 飞机草各部位提取物对铜绿假单胞菌 ATCC27853的抑菌作用

2.2 MIC测定飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、叶水提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草乙醇提取物对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC分别为16mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、4mg/ml、8mg/ml；上述提取物对金黄色葡萄球菌CMCC26001的MIC分别为16mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、4mg/ml、8mg/ml。飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、茎甲醇提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草甲醇提取物、全草乙醇提取物、全草丙酮提取物对肺炎链球菌ATCC49619的MIC分别为8mg/ml、16mg/ml、4mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、8mg/ml。仅飞机草叶水提取物可测得对大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853的MIC，分别为64mg/ml和128mg/ml。见表2。

表2 飞机草各部位提取物对5种细菌的MIC测定结果（mg/ml）

2.3 飞机草各部位提取物对感染金黄色葡萄球菌ATCC25923小鼠的保护情况根据体外抗菌结果，飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、叶水提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物、全草乙醇提取物对感染金黄色葡萄球菌ATCC 25923小鼠的保护情况见表3。

表3 飞机草各部位提取物对感染金黄色葡萄球菌ATCC25923小鼠的保护作用

2.4 飞机草各部位提取物对小鼠体内WBC及NEUT%水平的影响飞机草各部位提取物组WBC及NEUT%水平与空白对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 飞机草各部位提取物组WBC与空白对照组WBC及NEUT%比较（±s）

表4 飞机草各部位提取物组WBC与空白对照组WBC及NEUT%比较（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05

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2.5 病理结果对死亡的小鼠进行解剖，肉眼可见小鼠胃肠胀气，腹腔积液，可闻及恶臭味，部分小鼠肝脏、肺有出血，出血量不一，肾脏、脾及心脏肉眼未见明显变化。

小鼠感染金黄色葡萄球菌ATCC25923，灌胃给药后，与空白对照组相比，飞机草茎丙酮提取物与模型组的肝脏损伤最为严重，飞机草叶乙醇提取物、飞机草茎乙醇提取物、全草乙醇提取物组小鼠肝脏中度损伤，阳性对照组、飞机草叶甲醇提取物、叶丙酮提取物与叶水提取物组小鼠肝脏轻度损伤，具体表现为肝细胞点、灶状坏死，细胞核大小不等，大量炎症细胞浸润，见图6。飞机草各部位提取物组、阳性对照组、模型组肺损伤病理改变均较明显，表现为肺组织充血水肿，肺间质大量炎症细胞浸润，少量肺组织纤维化，见图7。各组均有一定程度肾损伤，具体表现为不同程度的炎细胞浸润，肾小球内皮细胞和系膜细胞弥漫性增生，毛细血管壁轻至中度损伤，并有部分新月体形成，见图8。

图6 小鼠感染金黄色葡萄球菌ATCC25923后的肝损伤情况（×400）

图7 小鼠感染金黄色葡萄球菌ATCC25923后的肺损伤情况（×400）

图8 小鼠感染金黄色葡萄球菌ATCC25923后的肾损伤情况（×400）

3 讨论

目前有研究报道飞机草提取物在体外实验中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等常见致病菌均具有不同程度的抑菌作用[13，14]。本课题就飞机草叶、茎、全草3个部位12种提取物针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923、金黄色葡萄球菌 CMCC26001、肺炎链球菌 ATCC49619、大肠埃希菌ATCC25922与铜绿假单胞菌 ATCC27853这5种常见致病菌进行了全面的体外抑菌作用研究，结果表明飞机草提取物对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌 ATCC25923、金黄色葡萄球菌 CMCC26001、肺炎链球菌 ATCC49619）具有较好的抑菌作用，仅飞机草叶水提取物对革兰氏阴性菌（大肠埃希菌ATCC25922与铜绿假单胞菌 ATCC27853）具有较弱的体外抑菌作用,这一结果表明飞机草叶水提取物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有一定的抑菌作用，飞机草叶水提取物的具体抑菌活性成分还需进一步研究，其抑菌作用机制也需深入探索。

目前关于飞机草体内抗菌作用的研究暂未见报道，且全球金黄色葡萄球菌感染率不断上升[15]，耐药性越来越强，死亡率也越来越高。在我国医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染率已经超过50%[16]，在美国MRSA感染率已经超过免疫缺陷综合征（ARDS）[17]。因此本研究选择金黄色葡萄球菌 ATCC25923对小鼠进行感染造模，同时，根据体外抗菌结果，选择飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、叶丙酮提取物、叶水提取物、茎乙醇提取物、茎丙酮提取物及全草乙醇提取物针对感染金黄色葡萄球菌 ATCC25923的小鼠进行了体内抗菌实验，结果表明飞机草叶水提取物组小鼠病死率为0，其小鼠病死率比阳性对照组还低，表明飞机草叶水提取物抗菌作用比青霉素强，且飞机草叶水提取物病理结果也显示其对肝、肾损伤相对较轻，结合体外抗菌实验结果，飞机草叶水提取物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有一定的体外抑菌效果，说明飞机草叶水提取物具有较大的转化为临床新型抗菌药物的价值。飞机草叶甲醇提取物、叶乙醇提取物、茎乙醇提取物对感染金黄色葡萄球菌ATCC25923的小鼠也具有一定的体内保护作用，小鼠的生存率也明显高于模型组，说明这3种提取物也具有一定的体内抗菌作用。

通过飞机草提取物的体外及体内抗菌实验，可以发现飞机草具有一定的抗菌效果。课题组前期就飞机草提取物的毒理学也进行了相关研究，表明其提取物对小鼠口服实际无毒，且由于其资源丰富，药理作用广泛，飞机草具有较大的药用价值。下一步可分析提取具体的化合物，对其抗菌靶点及作用机制进行深入研究，为开发及利用飞机草提供科学依据。