ROR2蛋白与肺腺癌患者临床特征及生存情况的关系*

李连凤， 周 婷， 余其梅， 林 慧， 王震宇， 秦灵芝， 孔宪荣， 廖 伟

武汉科技大学医学院 1公共卫生学院 2基础医学院，武汉 430065 华中科技大学同济医学院附属同济医院 3病理科 4放射科，武汉 430030 5武汉市第五医院呼吸与重症内科，武汉 430050

近年来，肺癌导致的死亡人数超过乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和脑癌所致死亡人数的总和，其中男性和女性的死亡率分别为23%和22%[1]。肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC，约占85%)和小细胞肺癌(SCLC，约占15%)两种类型，NSCLC的主要组织学类型是鳞癌与腺癌，而肺腺癌是肺癌中较常见的一种类型，约占肺癌总数的40%，且易发生侵袭和转移，5年平均生存率约为18%[2]。

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族在胚胎发育和疾病进展中具有重要作用，受体酪氨酸激酶样孤核受体2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)是其中的一种蛋白，属于Ⅰ型跨膜蛋白[3]，在发育期的胚胎中表达，存在于胚芽、心脏、原始生殖器、发育中的体细胞和间充质细胞中[4]。ROR2在调节细胞周期、迁移、增殖和分化等方面也发挥着重要作用[5]。肿瘤发生侵袭和转移依赖于细胞的极化作用，即细胞内的蛋白质转运到细胞膜表面。有研究发现ROR2信号通路会导致细胞极化，促使肿瘤细胞发生侵袭和转移[6]。在乳腺癌[7]、宫颈癌[8]、软骨肉瘤[9]、胰腺癌[4]、平滑肌肉瘤和胃肠道间质瘤[10]等多种恶性肿瘤中ROR2 mRNA或蛋白高表达与患者总体生存率较低相关；但另有研究报道在胃癌[3]、肝癌[5，11]和结直肠癌[12]中ROR2的表达下降。这表明在不同的癌症中ROR2蛋白的作用可能不尽相同。

目前，ROR2蛋白在肺腺癌患者体内的表达情况尚不清楚。本研究采用组织芯片及免疫组织化学法检测了ROR2蛋白在肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况，分析ROR2蛋白与肺腺癌患者临床特征及生存情况的关系，以期为早期干预和治疗肺腺癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究选取了华中科技大学同济医学院附属同济医院2010年3月至2015年9月入院后进行切除手术的235例肺腺癌患者，收集患者的年龄、性别、吸烟情况、肿瘤的分化类型、肿瘤大小、TNM分期、是否有淋巴结转移或远处转移、细胞增殖指数Ki67的表达量和是否接受放化疗等基本信息和临床特征资料。

在肿瘤分化类型中，微乳头型和实体型属于低分化(71例)，腺泡型和乳头型属于中分化(124例)，贴壁型为高分化(40例)；TNM分期是按照美国癌症联合委员会肺癌TNM分期第7版(2009年)标准进行分期，其中Ⅰ期52例、Ⅱ期37例、Ⅲ期99例、Ⅳ期47例。随访至2018年6月，存活患者56例，死亡患者179例。所有参与本研究的患者均签署了知情同意书，本研究获得华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会的批准。

1.2 组织芯片的制作

收集所有研究对象的肺癌组织和癌旁组织，分别取小块肺组织置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，再进行脱水、石蜡包埋、切片及苏木精-伊红(HE)染色，在显微镜下镜检，确定芯片取点部位。在取点前，稍加热蜡块，根据HE染色的结果定位，用取样器对目的部位的组织点进行取样，并按顺序依次注入到相应规格的受体蜡块孔内，再利用组织芯片融合仪(BP0100，Biossci公司)对芯片进行融合(60～65℃，20 min)，将熔好的芯片蜡块取出放于蜡模中，并用蜡填充满，再在制作好的组织芯片表面填充薄薄一层蜡，4 μm切片。

1.3 免疫组织化学(IHC)染色

将组织芯片的石蜡切片置于环保透明剂及梯度乙醇中脱蜡复水，蒸馏水冲洗，高温高压抗原修复1～2 min，冷却至室温，TBS冲洗3次，3%H2O2室温20 min，TBS冲洗3次，10%山羊血清孵育20 min，加ROR2一抗工作液(1∶200，Abcam，ab190145)4℃过夜，复温15 min，TBS冲洗3次，滴加50 μL DAKO二抗，室温孵育25 min，TBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，清水洗净、脱水、封片。在光学显微镜下观察ROR2蛋白的表达并拍照。

1.4 组织芯片IHC染色的结果判定

按染色颜色深浅对蛋白的表达程度进行半定量评分：未着色为0分，定义为阴性(-)；淡黄色为1分，定义为弱阳性(+)；棕黄色为2分，定义为阳性()；棕褐色为3分，定义为强阳性()。由5名经专业培训的人员在不知患者临床资料的情况下单独完成阅片，以3人以上的一致性评分作为最终的评分结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。符合正态分布的连续性变量采用两独立样本的t检验，不符合正态分布的连续性变量采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验，分类变量采用R×C卡方检验；ROR2在癌组织和癌旁组织表达的差异采用Wilcoxon配对样本秩和检验；不同临床特征与ROR2阳性表达程度的关系采用趋势性卡方检验；分层分析采用Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)卡方检验；以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌患者的临床特征分析

本研究中纳入的肺腺癌患者年龄在27～80岁之间，平均年龄为56.7岁。随访结束时存活病例有56例，平均年龄(53.86±8.64)岁；死亡病例有179例，平均年龄(57.33±9.98)岁，存活病例的平均年龄明显小于死亡病例，且差异具有统计学意义(P<0.05)。死亡病例中，癌组织为低分化类型、肿瘤大小>3 cm、TNM分期为Ⅱ～Ⅳ期以及发生淋巴结和远处转移的比例明显高于存活病例，且差异均具有统计学意义(均P<0.05)。而性别、吸烟情况、吸烟量、是否接受放化疗和ROR2蛋白表达程度等特征在两组人群中的分布差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 肺腺癌患者的临床特征分析

2.2 肺腺癌患者肺组织中ROR2蛋白的表达情况

如图1所示，肺部癌组织中的肺泡结构不完整，肺泡上皮细胞发生了增生性改变，癌组织多以贴壁型、乳头型和腺泡型腺癌为主。癌旁的肺组织结构基本正常，少部分出现增生性变化。ROR2蛋白在癌组织和癌旁组织中均有表达，呈现黄色或棕黄(褐)色的阳性颗粒，主要表达定位于腺癌细胞的细胞膜和细胞质内。235例肺腺癌患者中，49例(20.85%)患者癌组织中ROR2蛋白呈阴性表达，186例(79.15%)患者癌组织中ROR2蛋白呈阳性表达，其中112例(47.66%)为弱阳性，62例(26.38%)为阳性，12例(5.11%)为强阳性表达；在癌旁组织中，148例(62.98%)呈阴性表达，78例(33.19%)为弱阳性，9例(3.83%)为阳性表达，无强阳性表达。我们对ROR2蛋白在癌组织和癌旁组织的表达进行半定量分析，肺腺癌患者癌组织中ROR2蛋白的相对表达量明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.01)。

A、B：41号患者的癌组织和癌旁组织，评分分别为0分和2分；C、D：15号患者的癌组织和癌旁组织，评分分别为1分和0分；E、F：5号患者的癌组织和癌旁组织，评分分别为2分和0分；G、H：19号患者的癌组织和癌旁组织，评分分别为3分和1分。0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性。标尺=50 μm

2.3 肺腺癌的临床特征与癌组织中ROR2蛋白表达的关系

TNM分期达到Ⅲ和Ⅳ期，或者发生淋巴结转移的患者癌组织中ROR2蛋白阳性表达率明显高于肿瘤分期为Ⅰ和Ⅱ期或未发生淋巴结转移的患者(均P<0.05)，且在ROR2蛋白阳性表达的患者中，当细胞增殖指数Ki67≥50%、癌组织为低分化、TNM分期达到Ⅲ和Ⅳ期或发生淋巴结转移时，ROR2蛋白阳性或者强阳性表达率明显增加，且随着ROR2表达程度的增强而增加，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。而在性别、年龄、吸烟情况、分化程度、肿瘤大小、是否接受放化疗、生存率和远处转移率等方面ROR2蛋白阳性表达率无明显差异(均P>0.05)，见表2。

表2 肺腺癌的临床特征与癌组织中ROR2蛋白表达的关系[例(%)]

2.4 分层分析ROR2蛋白表达与肺腺癌患者生存情况的关系

根据不同的临床特征进行分层分析，结果显示，在从不吸烟、肿瘤大小≤3 cm、TNM分期为Ⅰ和Ⅱ期和未接受放化疗的患者中，ROR2高表达是肺腺癌患者发生死亡的危险因素，其OR及95%CI分别为3.42(1.11～10.56)、3.39(1.00～11.20)、3.37(1.03～10.97)和2.89(1.03～8.18)，见表3。

表3 分层分析ROR2蛋白表达与肺腺癌患者生存情况的关系

3 讨论

肺腺癌是非小细胞肺癌中较常见的一种亚型，TNM分期和淋巴结转移是影响肺腺癌患者预后的主要因素[13]。本研究结果显示，肺腺癌患者的存活情况与细胞的分化程度、肿瘤的大小、淋巴结转移和远处转移等密切相关，死亡病例中，癌组织为低中分化的类型、肿瘤大小>3 cm、TNM分期为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期以及发生淋巴结转移和远处转移的比例明显高于存活病例。有研究发现，低分化、淋巴结转移及远处转移均是肺腺癌总体生存期(OS)的独立危险因素[14]，与本研究结果一致。

本研究发现，ROR2蛋白在肺腺癌的癌组织和癌旁组织中均有表达，且癌组织中ROR2蛋白的相对表达量明显高于癌旁组织。Lu等[15]研究表明ROR2 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达水平显著高于匹配的正常组织；Huang等[4]研究发现ROR2 mRNA在胰腺癌患者癌组织中的表达量也显著高于癌旁组织，这与我们的研究结果一致。但有研究发现ROR2 mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织或者非癌组织(如慢性肝炎患者组织和肝硬化患者组织)[5，11]。因此，在不同的癌细胞或组织中，ROR2基因可能具有不同的调节作用。

本研究发现，在肺腺癌患者TNM分期达到Ⅲ和Ⅳ期或发生淋巴结转移时，ROR2蛋白阳性表达率较高，且在ROR2阳性表达的肺腺癌组织中，其阳性表达率会随着表达程度的增强而增高。有研究表明在非小细胞肺癌中ROR2高表达与TNM分期相关[15]，这与我们的研究结果基本一致。此外，在胰腺癌、胆囊鳞癌/腺鳞癌和腺癌及乳腺癌等癌组织中，ROR2的表达也与远处转移和TNM分期显著相关，且在晚期的表达量显著升高，有淋巴结转移的组织中ROR2阳性表达率也显著高于无淋巴结转移的癌组织[4，16-17]。早期的研究已发现，ROR2蛋白高表达会促进肿瘤细胞发生侵袭和转移[7]，因此，癌组织中ROR2的表达情况可能与肺腺癌的TNM分期以及是否会发生淋巴结转移密切相关。在ROR2蛋白阳性表达的肺腺癌患者中，当细胞增殖指数Ki67≥50%、肿瘤为低分化时，ROR2蛋白为阳性或者强阳性的表达率也显著增加。其中，癌组织的Ki67表达情况以及癌组织的分化程度与肺腺癌患者的预后密切相关，Ki67值越大，说明肿瘤细胞增殖能力越强，分化程度越低，患者的预后越差[18-19]。ROR2蛋白的表达也可能影响肿瘤细胞的增殖及恶化程度，但其相关的机制有待进一步的研究。

值得注意的是，在不吸烟患者、肿瘤大小≤3 cm、TNM分期为Ⅰ和Ⅱ期或未接受放化疗的肺腺癌患者中，癌组织中ROR2蛋白高表达是患者出现死亡的危险因素。有研究表明肺组织中ROR2异常高表达的非小细胞肺癌患者预后较差[15，20]，与本研究结果相似。这提示在肺腺癌发生的早期阶段，癌组织中ROR2的表达量与患者术后的生存情况有关，其在评估肺腺癌患者预后及是否需要进行放化疗等方面可能具有潜在的指导作用，为早期干预和治疗肺腺癌提供了新的思路。但由于本研究纳入的病例数量有限，因此ROR2在肺腺癌发生及发展过程中的作用尚需要进一步的探讨。

综上所述，癌组织中ROR2蛋白的表达情况与肺腺癌患者TNM分期、分化程度以及是否发生淋巴结转移等密切相关，且ROR2蛋白的高表达可能是肺腺癌患者术后出现死亡的危险因素之一。因此，检测肺组织中ROR2的表达情况可能为早期干预和治疗肺腺癌提供新的思路。