顶空气相色谱法测定瑞舒伐他汀钙合成中间物料的有机溶剂残留

斯智萍，徐世芳

（1.浙江核力欣健药业有限公司，浙江 湖州 313000； 2.杭州医学院，浙江 杭州 310013）

瑞舒伐他汀钙为全化学合成药，自日本盐野义制药株式会社首次研发成功（专利号：JP5178841B）以来，不少生产厂家研究出了不同的合成工艺路线。其中，英国阿斯利康公司（获得该药的技术转让）率先提出了将嘧啶母核做成磷盐，将叔丁酯做成侧链醛，然后经Wittig反应缩合得到瑞舒伐他汀骨架，再经脱保护、碱水解而转化成钙盐，从而得到瑞舒伐他汀钙[1－4]。该经典合成线路中，叔丁酯侧链醛[（4R－顺式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己环－4－乙酸叔丁酯]作为关键的中间物料逐渐市场化，分析其合成工艺，该产品可能残留乙醇、乙醛、甲苯、二甲硫醚等有机溶剂。为考察所购叔丁酯侧链醛的质量，进一步控制瑞舒伐他汀钙的产品质量，本研究中采用顶空气相色谱法对叔丁酯侧链醛中的乙醇、乙醛、甲苯、二甲硫醚的残留进行了考察，并进行了方法学研究，以期为瑞舒伐他汀钙合成中间物料的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

7890A型气相色谱仪、7697A型顶空进样器（美国Agilent公司）；QP 2010 Ultra/SE型气质联用仪（日本Shimadzu公司）；XPE205型电子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 试药

乙醇（色谱纯，批号为K48709227），二甲基亚砜（色谱纯，批号为10956900），均购自Merck KgaA公司；乙醛（Aladdin Industrial Corporation，批号为20181208，含量为99%）；二甲硫醚（西格玛奥德里奇＜上海＞贸易有限公司，批号为20180706，含量≥99.0%）；甲苯（杭州双林化工试剂厂，批号为20141008，含量≥99.5%）；（4R－顺式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己环－4－乙酸叔丁酯样品（江苏某制药有限公司，物料代号为DK001Y－SM2，批号为SQ－D7－160701）。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为以6%氰丙基苯基－94%二甲基聚硅氧烷为固定相的Rtx－624毛细管柱（60 m×0.25 mm，1.4μm），程序升温（初始温度为60℃，保持15 min，以40℃/min的速率升至240℃，保持5 min）；火焰离子化检测器，检测器温度为250℃，进样口温度为200℃，分流比为30∶1，载气为氮气；顶空进样，平衡温度为90℃，平衡时间为30 min，定量环温度为120℃，传输线温度为130℃；进样量为1 mL。

质谱条件：GCMSSolution 2.71工作站；电子轰击（EI）离子源，离子源温度230℃，传输线温度250℃；扫描模式Full Scan，质量扫描范围m/z为45～550。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：称取乙醇、乙醛、二甲硫醚及甲苯对照品各适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解，制成每1 mL约含乙醇50 mg、乙醛38.5 mg、甲苯9 mg及二甲硫醚10 mg的混合对照品贮备液；逐级稀释，制成每1 mL含乙醇0.5 mg、乙醛0.385 mg、甲苯0.09 mg及二甲硫醚0.1 mg的混合对照品溶液。

供试品溶液：称取样品0.5 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，精密加入5 mL二甲基亚砜，即得，压盖密封。

空白溶剂：以二甲基亚砜作为空白溶剂。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密量取混合对照品溶液、空白溶剂及100%限度浓度加标供试品溶液各5.0 mL，分别置20 mL顶空瓶中，压盖密封。按2.1项下色谱条件进样测定，记录气相色谱图。结果空白溶剂对样品测定无干扰，供试品溶液中含有多个其他未知峰，但所测溶剂乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯峰与各相邻色谱峰的分离度均大于1.5。详见图1。

图1 典型气相色谱图1.acetaldehyde 2.ethanol 3.dimethyl sulfide 4.tolueneA.Blank solvent B.Mixed reference solution C.Spiked test solutionFig.1 Typical GC chromatograms

线性关系考察：精密量取混合对照品贮备液0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，2.0 mL，分别置100 mL容量瓶中，用二甲基亚砜定容，即得残留溶剂系列混合对照品溶液。各精密量取5 mL，置20 mL顶空瓶中，压盖密封。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标、各待测成分质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程及线性范围。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度试验：精密量取混合对照品溶液5 mL，置20 mL顶空瓶中，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯峰面积的RSD均小于10.0%（n=6），表明仪器的精密度良好。

检测限与定量限考察：将2.2项下混合对照品溶液逐级稀释，分别以信噪比（S/N）为3和10时的质量浓度作为检测限和定量限。进样分析，记录气相色谱图，测得乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯的检测限和定量限（见表2）。定量限的精密度RSD均小于10%（n=6），表明该方法灵敏度好。

表2 检测限与定量限检测结果Tab.2 Results of LOD and LOQ

回收率试验：取混合对照品贮备液0.8，1.0，1.2mL，分别置100 mL容量瓶中，配制低、中、高3种质量浓度（各溶剂限度的80%，100%，120%）的混合对照品溶液。取样品0.5 g，置20 mL顶空瓶中，分别精密加入3种不同浓度的混合对照品溶液各5.0 mL，每种浓度各制备3份。按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，按外标法计算回收率。结果见表3至表6。

表3 乙醛回收率试验结果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of acetaldehyde（n=9）

表4 乙醇回收率试验结果（n=9）Tab.4 Results of the recovery test of ethanol（n=9）

表5 二甲硫醚回收率试验结果（n=9）Tab.5 Results of the recovery test of dimethyl sulfide（n=9）

表6 甲苯回收率试验结果（n=9）Tab.6 Results of the recovery test of toluene（n=9）

2.4 样品含量测定

取样品0.5 g，依法制备供试品溶液，平行2份，按2.1项下试验条件进样检测，记录色谱图（见图2）。结果供试品溶液中乙醛、乙醇、二甲硫醚、甲苯的含量分别为0.002%，0.008%，0.001%，0.005%。

图2 供试品溶液气相色谱图1.acetaldehyde 2.ethanol 3.dimethyl sulfide 4.tolueneFig.2 GC chromatograms of test solution

为进一步鉴定样品中未知溶剂峰，按2.1项下试验条件，对供试品溶液进行气相色谱串联质谱（GC－MS）分析，结果见图3。结合NIST谱库检索功能，扣除空白溶剂峰的干扰，对供试品溶液中较大的10个未知峰进行结构归属，鉴定结果见表7。

表7 供试品溶液中10种鉴定的未知化合物结构信息表Tab.7 Structure information of 10 unknown compounds identified in the test solution

图3 供试品溶液气相色谱串联质谱总离子流图Fig.3 Total ion flow of test solution by GC-MS/MS

3 讨论

3.1 进样方式选择

气相色谱的进样方式有直接进样及顶空进样。直接进样快速、方便、准确，顶空进样温度较低，可避免样品热解损失及非挥发性物质对进样口和毛细管柱的污染[5－9]。预试验中，样品在直接进样－气相色谱分析中，主成分有较大响应，导致某些残留溶剂可能被包裹在主成分中而漏检，故最终选择顶空进样方式。

3.2 溶剂选择

顶空气相色谱法选用的溶剂多为水，但由于该中间物料不溶于水，故先后考虑了溶解能力较强的二甲基亚砜及二甲基甲酰胺。待测残留溶剂甲苯的沸点较高，出峰靠后，为了不干扰测定，最终选择了二甲基亚砜。

3.3 顶空条件选择

预试验中采用单因素考察方法确定了最佳平衡时间和平衡温度。固定平衡时间，考察不同平衡温度（70，80，90，100℃）下待测成分响应值的变化，发现随着温度的升高，待测成分响应值增加，但由于90℃与100℃的响应值无明显差异，考虑温度过高可能使样品发生热解，故选择平衡温度为90℃。固定平衡温度，考察不同平衡时间（20，25，30，35 min）对待测成分响应值的影响，发现平衡30 min后再继续延长平衡时间，待测成分的响应值并无明显增加，故选择平衡时间为30 min。

3.4 顶空瓶溶剂体积选择

顶空体积的大小对检测灵敏度、精密度有重要影响[10]。预试验中分别考察了溶剂体积为1，3，5，7 mL时待测成分响应值的变化。结果发现，当溶剂体积小于顶空瓶体积的1/3时，随着溶剂体积的增加，响应值增加；溶剂体积为7 mL时的响应值与5 mL时无明显差异，且精密度略有降低，故将溶剂体积确定为5 mL。

3.5 供试品中其他未知溶剂峰的鉴定

为进一步鉴定样品中的未知溶剂峰，采用GC－MS法对供试品溶液中较大的10个未知峰进行了结构鉴定。由于样品为供应商提供的工艺研究批次样品，对乙醛、乙醇、二甲硫醚和甲苯等4种残留有机溶剂测定的目的，只是为供应商提供一种有机溶剂残留量测定参考方法，故未对鉴定出的10种含量较大的溶剂峰做进一步追溯。后续需与物料供应商接洽反馈该试验结果，建议其从生产工艺及试验溶剂着手，在生产过程中加上溶剂清洗的步骤，对该物料做进一步纯化处理，并要求供应商对优化工艺再行分析，根据实际情况对残留溶剂进行定量控制，做好中间物料的控制。

3.6 方法评价

本研究中通过对溶剂、顶空平衡时间及平衡温度等条件的优化试验，建立了对测定瑞舒伐他汀钙合成中间物料（4R－顺式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己环－4－乙酸叔丁酯中的乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯等4种有机溶剂残留量的顶空气相色谱法。该方法操作简便，灵敏度高，准确度好，各组分间的分离度较好。该研究为复杂样品基质中有机溶剂残留量的测定提供了参考，为供应商对该物料的生产纯化提供了方向。