1例罕见ATR-X综合征的基因突变分析

袁军鸿， 段丽芬， 刘晓梅， 张云茜， 刘红仙， 孙 浩， 褚嘉祐， 杨昭庆

ATR-X综合征也称X连锁的α地中海贫血智力障碍综合征(Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability，ATR-X；OMIM：301040)，是由X染色体上的ATRX基因突变引起的罕见遗传病[1]。ATR-X综合征的致病基因位于Xq21.1，编码了2492个氨基酸，所编码的蛋白质是染色质重塑因子SNF2(SWI/SNF)家族成员，在体外具有一定的染色质重塑活性[2]。ATRX 基因包含约300 kb的基因组DNA，由35个外显子组成[3,4]。ATR-X综合征的临床表现多为面部畸形、严重智力低下、轻度(或无)α-地中海贫血、生殖器不同程度的异常、骨骼异常和自闭症行为[5]。该综合征具有较广的基因突变谱和临床表型谱，但基因型与临床表型的对应关系尚不清楚。本研究通过全外显子组测序对一个核心家系中临床表现为智力低下、异常面容伴阵发性抽搐的患者进行致病基因突变筛查，发现了ATRX基因上一个单碱基致病基因突变，现报道如下。

1 临床资料

1.1 研究对象 获取一个来自云南的家系(见图1)，先证者为男性，6岁，汉族，以癫痫入院，行体格检查、血液学常规及心电图、脑电图、心脏彩超、MRI及染色体核型分析等临床检测；父母为非近亲婚配，无家族遗传史，家系中其他成员未见相似异常表型。临床为癫痫。

图1 ATR-X综合征家系图。箭头所示为先证者

1.2 临床表型 先证者一般情况差，智力低下，发育落后，具有特殊面容如：眼距宽、鼻梁低平、小三角鼻、舌体大、嘴大、牙齿发育不良、耳位低、招风耳(见图2)，患者手、脚骨骼未出现明显异常，血液学常规检测显示血红蛋白(Hb)为124.00 g/L，平均红细胞体积(MCV)为88.00 fl，平均红细胞血红蛋白量(MCH)为27.60 pg，未呈现α地贫异常指标。心脏检查结果提示：(1)双上腔静脉、主动脉窦部增宽；(2)双下肺静脉共干；脑电图显示清醒期背景θ活动异常增多；头部MRI检查提示局部脑沟稍有加深；生殖器未见异常；染色体核型正常；颈部CT平扫未见异常征象。上述结果表明，患者呈现的临床表型符合ATR-X综合征的大部分典型临床表型。该家系中其他人员的表型均未见异常。

图2 患者面部特征。患者呈现特殊面容，包括眼距宽、鼻梁低平，小三角鼻、舌体大，嘴大，牙齿 发育不良、耳位低、招风耳

1.3 外周血全基因组DNA的提取及全外显子组测序 根据知情同意原则，获取该家系5名成员(Ⅱ、Ⅲ)抗凝外周静脉血约2 ml，采用AxyPrepTMBlood Genomic DNA Miniprep Kit(Axygen，江苏康宁生命科学有限公司)提取基因组 DNA。对先证者DNA进行全外显子组测序，检测到ATRX基因(NM_000489)第7外显子中一个错义碱基突变:c.A536G(p.N179S)。该突变位点的基因频率在千人基因组数据库，美国国家心肺和血液研究所外显子测序计划(esp6500siv2)，ExAC数据库(Exome Aggregation Consortium)、gnomAD_exome数据库(Genome Aggregation Database)中均为0，在美国国立卫生研究院临床变异位点数据库(NCBI CLINV AR)中显示为致病突变。

1.4 Sanger测序检测ARTX基因变异位点 对全外显子组筛查所得的可疑候选基因突变位点采用Sanger DNA测序在家系成员中进行检测，利用Geneious生物信息分析软件(Biomatters Inc，美国)设计扩增ATRX基因片段的引物。正向引物序列(5’-3’)为 TTGCCAAGGTTGTCATGTGC，反向引物(5’-3’)为CCGGTGTGCTCCCATAATCA，扩增片段长度为494 bp。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析和纯化后进行Sanger DNA测序，测序结果采用Geneious软件进行序列比对和分析。家系成员中基因突变位点的代表性Sanger测序结果(见图3)。男性先证者为该突变位点的纯合子(半合子)，其母亲(Ⅱ1)和一个妹妹(Ⅲ3)是该突变位点的杂合子，为突变携带者；其父亲(Ⅱ2)和另一个妹妹(Ⅲ2)的该位点为野生型，突变传递符合ATR-X综合征以X连锁模式遗传的特征。

图3 ATRX基因部分Sanger测序结果。先证者为ATXR NM_000489：c.A536G突变的纯合子，其父亲为野生型，其母亲为该位点突变的杂合子

1.5 变异位点的蛋白结构分析 采用I-TASSER软件(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)对包含突变位点在内的ATRX基因(NM_000489)第一外显子至第九外显子的氨基酸序列进行蛋白质结构和功能预测。通过I-TASSER软件预测的ATXR蛋白质三级结构最优模型(见图4)[6～8]。对野生型和突变型蛋白进行功能预测的结果发现：(1)在结合位点方面两者的功能都与PDB数据库中3qlaD蛋白模块相似，都存在 ADD结构域；(2)在酶活性位点方面，野生型蛋白的功能与PDB数据库中3eqlD功能相似，主要发挥转移酶活性；而突变型蛋白的功能与PDB数据库中1b0pA相似，主要发挥氧化还原酶功能，结果表明突变型与野生型蛋白质的功能可能有所不同。

图4 ATRX(NP_000480.3)野生型和p.N179S突变型蛋白质三级结构预测。箭头所指红色部分为突变位点

1.6 ATRX基因c.A536G(p.N179S)突变的表型特征 本研究与国外文献中报道c.A536G突变位点男性患者的主要临床表型特征(见表1)。结果显示携该突变通常会导致患者出现面容畸形及不同程度的智力低下，呈现出共性特征。但同时该疾病的临床表型也具有明显的异质性，即相同基因突变在不同个体中呈现出不同的临床表型。

表1 ATRX基因c.A536G的临床表型

2 讨 论

本文对1例临床表现为智力低下伴有癫痫，具有特殊面容的患者进行了全外显子组测序，结果在ATRX基因(NM_000489)第7外显子上发现了一个碱基突变:c.A536G(p.N179S)。该突变位点在国外病例中已有报道，表明该突变位点为ATR-X综合征的一个致病突变位点。本研究中患者具有ATRX综合征典型的临床特征，如智力低下、面容异常等，但该患者染色体核型正常，因此与一般的染色体疾病所致的智力低下有所区别。通过患者基因全外显子测序及sanger测序检测到该致病突变，并发现突变与表型的遗传方式在该家系中呈现X-连锁隐性遗传病特征，由此确诊为ATR-X综合征患者。通过I-TASSER软件分析该突变位点对蛋白结构和表达方面影响，发现该突变位点位于ATRX基因的ATRX-DNMT3-DNMT3L(ADD)锌指结构域，其改变可能会引起ATRX-DNMT3-DNMT3L(ADD)锌指结构域的空间结构发生改变，从而使某些酶活性位点发生改变。锌指结构域已被证明在体外具有与DNA结合的活性，通过蛋白质印迹和免疫细胞化学分析均表明，在具有锌指结构域突变的ATR-X综合征患者中，ATRX蛋白的表达通常会发生改变或缺失[11]。ATRX蛋白在有丝分裂时与染色体的结合伴随着蛋白质的磷酸化及其与异染色质蛋白1α(HP1α)的结合[12,13]。综上，c.A536G突变患者所表现出的ATR-X综合征推测可能是由于该突变导致了锌指结构域的改变，从而影响了ATRX蛋白与染色质的结合以及后续基因的表达，进而导致疾病的发生。

ATR-X综合征具有明显的临床异质性，其中遗传异质性是一个主要原因，不同突变位点和突变性质可导致不同的临床表型。临床异质性还表现在具有相同基因突变的ATR-X综合征患者之间仍然呈现出不同的表型，其原因可能是因为ATRX蛋白除了与异染色质的结合外，在有丝分裂中期也会与人类近端着丝粒染色体的短臂结合，而这些短臂上存在一些具有不同重复序列的核糖体DNA(rDNA)[14]，推测其可能导致相同的突变引起不同的病例效应，但相关的作用机制目前尚不清楚。之前对1例具有相同突变患者的研究发现了严重智力低下、异常面容、生殖器异常及骨骼异常的症状[9]，但本例中患者并未发现明显的生殖器异常及骨骼异常(见表1)。除此之外，不同的突变位点产生的临床表型也不一样，ATR-X综合征的突变区多发生在两个较为保守的区域，即ADD区域和解旋酶区。发生在ADD区域的突变通常会导致较为严重的临床表现，而发生在解旋酶区的突变所导致的临床表型通常较前者轻。在同一突变区域内不同位点的突变也存在临床异质性。如有文献报道1例ATR-X综合征患者在其ATRX基因第9外显子存在c.736C>T (p.R246C)突变，且该位点的突变导致患者具有所有典型的ATR-X临床表型，包括面容畸形、智力低下、α地中海贫血、生殖道异常、骨骼异常及流涎等[15]，而同样处在该突变区域的本例研究中未发现α地中海贫血、生殖道异常等临床表型。这些研究结果进一步展现出ATR-X综合征具有明显的临床异质性。

除此之外，相同突变的来源可有不同，本研究患者遗传自母亲，但1例与本例研究具有相同位点突变的报道显示发生在该例患者的ATRX基因c.A536G错义突变为一新生(De Novo)突变[10]，对于X连锁的新生突变发生的情况有多种，一种情况可能是发生在患者本身，而其母并不是携带者；也有可能是患者的母亲的生殖细胞是嵌合体，其在有丝分裂过程中发生突变，但只是部分卵母细胞携带了突变的 X染色体。所以该研究也为遗传咨询和产前诊断提供更多的依据和线索。

本文通过全外显子测序确定了1例罕见α地中海贫血X连锁智力障碍综合征患者家系中的基因突变，丰富了中国人中ATR-X综合征的基因突变谱和临床表型谱，为ATR-X综合征临床表型异质性和基因型的关系提供了更多的实验证据，对该疾病的诊断、治疗及遗传咨询提供了更多参考依据。但由于受患者和家系样本数量的局限性，对于所发现致病突变关联的表型异质性机制如ATRX基因与染色质的相互作用效应等还需要深入探讨和研究，从而对罕见病防控和诊疗提供更多的理论线索和解决方案。