血管内皮生长因子及其基因多态性与脑微出血的关系*

肖庆博 郭 霞 吴丽娥 刘 颖 刘美玉 于文龙 白茹玉 禹延雪

内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经内科，内蒙古包头市 014010

脑微出血(Cerebral microbleeds，CMBs)作为脑小血管病的重要影像学分类之一，通常在T2*加权梯度回波序列和SWI上多表现为散在的直径2～5mm、偶最大达1cm的圆形或类圆形低信号影[1]，且无周围水肿。在临床中可无任何症状和体征，却可使患者发生痴呆、认知下降等风险增加[2]，甚至导致患者死亡，故视为一种亚临床损害。 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管内皮细胞的特异性肝素结合生长因子，具有促进血管内皮细胞分裂增殖进而促进脆弱血管和淋巴管的新生、增加血管通透性等生物学特性。研究发现，VEGF及其基因多态性与糖尿病肾病、增殖性糖尿病视网膜病变等微血管损害风险增加相关[3-4]。脑部微血管和糖尿病损伤肾脏、视网膜微血管有着相似的血流动力学，应变着心室收缩期高压、高速血流冲击，故推测脑微出血的发生与VEGF及其基因多态性具有相关性。国内外目前尚无关于VEGF及其基因多态性与脑微出血相关性文献报道，本研究旨在探讨VEGF及VEGF-2578C/A基因多态性与脑微出血的关系，为脑微出血防治提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 将2017年12月—2019年12月于我院神经内二科诊治的76例脑微出血患者设为病例组，同期75例无脑微出血患者为对照组，根据2015年《中国脑小血管病诊治专家共识》CMBs的影像学标准诊断CMBs：磁共振SWI序列上圆形或卵圆形、质地均一，直径2～5mm 且周围无水肿的低信号病灶，并除外颅内钙化。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)入院完善各项抽血化验且经头颅MRI和SWI检查确诊的CMBs患者。排除标准：(1)≤14d的急性脑血管病患者；(2)影像学疑似多发性硬化、视神经脊髓炎等白质变性疾病；(3)经头颅CT或MRI证实有毛细血管扩张症、动静脉畸形、海绵状血管瘤等血管畸形者；(4)有明确脑外伤病史、脑肿瘤患者；(5)有严重多脏器功能衰竭、重症感染、血液系统疾病、自身免疫疾病；(6)有心脏起搏器者、恶性肿瘤、糖尿病微血管病者；(7)精神异常、癫痫发作等不能配合检查者。

1.2 主要试剂与仪器 VEGF ELISA试剂盒(Jiangsu Yutong Biological TechnologyCo.,Ltd)、血液基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)、PCR酶预混剂、订购限制性内切酶BglⅡ，查阅相关文献及Gegebank数据库，用primer premier5.0设计VEGF -2578C/A基因位点的引物，并由上海Sangon Biotech公司合成，序列如下：上游引物：5’-GCCTTAGGACACCATACCGATG-3’,下游引物：5’-GCTGCCCCAGGAACAAAGTTG-3’，离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，PCR仪、凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)等。

1.3 研究方法 (1)受检者入院后详细登记一般信息，记录既往史，完善血常规、尿常规、血糖、血脂、凝血功能等化验，完善头颅核磁、SWI检查(CMBs由一名影像科专家及两名高级职称神经内科医师共同确定)；(2)第2日晨起6时空腹抽血两管，一管分离血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清VEGF 浓度；(3)另一管分离白细胞，使用基因组 DNA 提取试剂盒提取全血DNA；采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测VEGF-2578C/A基因多态性，PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次，最后72℃延伸7min，扩增后使用限制性内切酶Bgl Ⅱ对产物进行酶切。扩增产物及maker行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察片段大小，得出VEGF-2578C/A基因型：CC：285bp，CA：285bp、206bp、79bp，AA：206bp、79bp。见图1。

图1 VEGF -2578C/A基因型

2 结果

2.1 两组基线资料及VEGF浓度情况 两组性别、糖尿病与否差异无统计学意义(P>0.05)，白细胞计数、甘油三酯、高密度脂蛋白、血肌酐差异无统计学意义(P>0.05)，未予列出；年龄、高血压、VEGF差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 二元Logistic回归分析 以CMBs为应变量，将年龄、高血压病、血清VEGF浓度作为自变量，作多因素非条件Logistic回归分析后显示年龄、高血压仍与CMBs的发生相关，且血清VEGF浓度是CMBs发生的独立危险因素。见表2。

表2 影响CMBs发生的多因素Logistic回归分析

2.3 Hardy-Weinberg平衡检验 应用Hardy-Weinberg公式计算两组VEGF-2578C/A基因型频率观察与对照数，两者间差异无统计学意义(P>0.05)，表明本研究对照组资料具有群体代表性。

2.4 基因型分析 两组VEGF-2578C/A位点等位基因(C/A)和基因型(CC、CA、AA)分布，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。校正混杂因素后行多因素Logistic回归，与AA基因型相比，CC基因型为CMBs发生的易感基因(P<0.05，OR=4.714,95%CI：1.611～13.796)；与CC基因型相比，AA基因型为保护基因(P<0.05，OR=0.212,95%CI：0.072～0.621)。

表3 两组VEGF基因型和等位基因比较[n(%)]

3 讨论

近年来神经科对脑小血管病的研究可谓炙手可热，尤其是微出血。研究表明CMBs在中老年人群患病率为11.1%～15.3%，随着年龄的增长或合并有阿尔茨海默病、其他脑血管病其患病率均有不同程度的升高[5]；目前关于CMBs发病的确切机制尚不甚明确，普遍认为高血压和脑血管淀粉样变与CMBs的发生密切相关；最新关于脑小血管病发病机制的文献比较认可可能与慢性缺血/低灌注假说、血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)损害及遗传等因素[6]相关，与前人研究CMBs发生的病理机理基本一致。由于长期缺血，各种炎性因子释放，血管内皮功能破坏，BBB通透性增高等单独或一系列级联反应，最终导致CMBs发生。血脑屏障主要由紧密连接的血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元等形成的神经血管单元，是脑内稳态的重要结构[7]。VEGF作为一种重要炎症因子，必然参加了CMBs发生过程。VEGF是已知的促进血管生成最强的因子之一，亦有很强的血管通透诱导作用，VEGF水平升高是BBB通透性增加关键环节，国外学者最新研究通过动物实验利用高渗盐水介导内皮细胞—一氧化氮合酶通路探讨改善脑水肿的可能机制发现，高渗盐水通过抑制VEGF及其蛋白表达水平下调进而阻断上述通路，使BBB通透性降低从而减轻脑水肿[8]；另一方面，由于缺血缺氧，促进VEGF、PDGF等血管生成因子产生，并与内皮细胞膜受体结合促进血管生成，同时此种条件下基质金属蛋白酶等多种内皮细胞损伤标志物[9]相应产生，它们之间的不平衡、不协调就会导致内皮细胞功能障碍，造成新生血管不成熟、不稳定、功能差而促发CMBs。由此可推测，VEGF必然参与了CMBs的形成。

目前关于VEGF基因多态性的研究，国内外优秀学者已经发掘到诸多疾病领域，例如糖尿病视网膜病变、脑卒中、癌症、子宫内膜异位症及多囊卵巢综合征等妇科疾病。Dai C等[10]发现VEGF-C基因多态性与类风湿关节炎关系密切，同时记载VEGF-C基因多态性同口腔癌、尿路上皮细胞癌和冠状动脉疾病的发生相关，且可作为预测疾病的靶点；外国学者[11]通过分析玻璃体内注射抗VEGF治疗年龄相关黄斑变性效果的不同，测试出VEGF通路中各基因单核苷酸多态性不同，也不难预测VEGF与年龄相关性黄斑变性有关。

本研究基于前人关于VEGF及其基因多态性和糖尿病肾病、视网膜等微血管损伤相关的研究，考虑脑部微血管与这些微血管生理及解剖的相似性，再次明确了VEGF的升高可能是CMBs发生的独立危险因素，证实了VEGF-2578C/A基因有CC、CA、AA三种基因型，运用Hardy-Weinberg平衡检验各组基因型，差异无统计学意义，证明具有群体代表性。而且校正混杂因素后CC基因型者CMBs发病率显著高于AA型，且为AA型的4.714倍，提示C等位基因可能是CMBs的易感基因。有文献记载Hcy可能也是CMBs的危险因素，本实验两组Hcy水平则无明显差异，可能原因为前人大多研究均是基于脑梗死合并CMBs病例，Hcy水平受脑梗死的影响较大，以及本实验对象的选择可能存在入院率偏倚造成，因此本实验尚不能得出Hcy是CMBs发生的危险因素的证据。

血清VEGF浓度及VEGF-2578C/A基因多态性可能与CMBs的发生具有相关性。因本研究尚存在局限之处：研究为单中心的创新性研究，样本量偏小，针对CMBs复杂的发病机制，不足以说明具体问题；且研究为单调的VEGF-2578C/A基因位点，难以校正或消除VEGF基因其他位点多态性、VEGF家族基因甚至机体各种因子间相互作用产生的可能影响。若将VEGF-2578C/A作为CMBs发生的预测指标需要后续进行多中心、大样本量、多基因位点分析更具说服力，但也无疑为CMBs的治疗提供了新思路，对传统危险因素进行严格控制或许仍然是治疗或预防CMBs的主要方法，由本研究可知未来CMBs的防治应考虑以内皮细胞功能、BBB 和微血管本身功能为靶点。可以大胆想象，未来是否可以采用针对抗VEGF基因多态性治疗，或人为注射消除VEGF因子的“新药物”治疗，但具体注射的部位及量，值得后继者们长期不懈的艰辛探索。