转录因子EB通过激活自噬及溶酶体功能改善缺血性卒中小鼠神经功能*

周大旺 ， 张晨禹 ， 黎 博 ， 张 强 ， 刘 聪 ，詹浩洪 ， 胡春林 △， 廖晓星 ，4△

（1中山大学附属第七医院急诊与灾难医学中心，广东深圳518107；中山大学附属第一医院2急诊科，3卫生部辅助循环重点实验室，广东广州510080；4中山大学深圳研究院，广东深圳518057）

根据2019 年全球疾病负担报告，在导致全球疾病负担增加的疾病中，脑卒中是仅次于缺血性心脏病和糖尿病的全球性疾病［1］。脑卒中分为出血性卒中及缺血性卒中，其中以缺血性卒中为主，具有较高的致死率和致残率［2-3］。缺血性脑损伤会引发一系列病理改变，包括兴奋性毒性、细胞凋亡和炎症反应等，最终导致神经元死亡［4］。研究表明自噬及溶酶体功能在脑缺血性损伤中扮演着重要角色，不仅参与缺血损伤的发生、发展过程，还有可能作为干预、调控的切入点来影响甚至决定受损神经元的转归［5］。转录因子 EB（transcription factors EB，TFEB）作为调控自噬及溶酶体功能的关键因子［6］，可能成为改善神经系统疾病患者预后的潜在治疗靶点［7-10］。本项工作首先通过构建不同梗死时间段永久性大脑中动脉阻塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型，观察TFEB介导的自噬及溶酶体功能在pMCAO 模型中的改变，随后通过敲减和过表达TFEB，观察其对pMCAO 模型小鼠神经功能的影响，为缺血性卒中寻找新的治疗靶点。

材料和方法

1 实验动物

60只SPF 级C57BL/6雄性小鼠，周龄8～10周，体重25～30 g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，动物生产许可证号为SCXK（苏）2018-0008。其中15只用于构建不同梗阻时间pMCAO 模型，分为假手术（sham）组、梗阻2 h组、梗阻4 h组、梗阻8 h组和梗阻24 h 组，每组 3 只；另外 45 只用于注射 9 型腺相关病毒（adeno-associated virus serotype 9，AAV9）及后续pMCAO 的构建，梗阻时间为24 h，分为假手术组、TFEB过表达组（AAV9-TFEB 组）、过表达对照组（AAV9-NC 组）、TFEB敲减组（AAV9-shTFEB 组）和敲减对照组（AAV9-shNC 组），每组9 只。所有实验小鼠均饲养于中山大学动物中心SPF 级动物房，所有实验操作均符合中山大学动物实验中心伦理委员会要求并按照实验动物使用原则执行。

2 主要仪器和试剂

脑立体定位仪（瑞沃德）；小鼠微量注射泵（深圳徕越生物技术有限公司）；小动物磁共振系统（Aspect M3）；组织血流扫描成像分析系统（PERIMED PSI-ZR）。戊巴比妥钠购自Sigma；抗TFEB 抗体购自absin；抗 LC3B 抗体、抗 caspase-3 抗体和抗 β-actin 抗体购自CST；抗溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP-1）抗体购自Abcam；TUNEL 试剂盒购自Roche；9 型腺相关病毒购自山东维真生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 AAV9 侧脑室注射 用1.0%的戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，根据脑立体定位仪定位，用微量注射泵将AAV9 以1 μL/min 流速注入侧脑室，注射总体积10 μL，各组9 型腺相关病毒稀释后滴度均为1×1016μg/L。

3.2 模型制备及神经功能评分 采用栓线法制备pMACO 模型［11］，小鼠用1.0%戊巴比妥钠麻醉后固定，沿颈正中切开，分离颈部筋膜组织，将右侧颈内动脉、颈外动脉及颈总动脉充分暴露；5-0 丝线结扎颈总动脉近心端，显微血管夹夹闭颈外动脉，5-0 丝线牵拉颈总动脉远心端阻断血流；于颈总动脉中部剪一小口，将头端包被硅胶的MACO 栓线缓慢送入颈总动脉，由颈总动脉近分叉处进入颈内动脉，向上直至大脑中动脉前端，达到阻断大脑中动脉血流的效果，栓线进入深度约距离颈内、外动脉分叉处10 mm；5-0 丝线固定线栓，剪掉尾端多余部分；缝合手术切口，小鼠于37 ℃保温毯上复苏；采用Longa 等［11］的5 级4 分法标准对实验动物进行功能缺损评分：0分：正常，明显神经功能学损伤症状未见；1 分：梗阻对侧前爪不能完全伸展，神经功能缺损轻度；2分：爬行时向瘫痪侧旋转，神经功能缺损中度；3分：爬行时向瘫痪侧倾倒，神经功能缺损重度；4分：不能自发行走，意识部分丧失。

3.3 血流灌注成像分析 采用PSI血流灌注成像系统进行脑血流检测，小鼠麻醉后俯卧位固定于脑立体定位仪上，矢状突切开头皮至颅骨，充分暴露整个颅骨，将激光多普勒探头放置于颅骨正上方约10 cm处，PIMSoft 操作软件设定参数（图像尺寸：宽度2.2 cm，高度2.2 cm；采样频率：18 图像/s；分辨率：0.040 mm；每次记录30 s），造模前及造模后各采集1 次图像，使用PIMSoft操作软件进行图像分析处理。

3.4 MRI 成像及分析 采用Aspect 公司的1.0 T 小动物磁共振扫描仪（Aspect M3）对动物进行冠状位扫描。 T2WI 扫描序列参数：TR/TE 7663.294 ms/76.67 ms，层厚 1.0 mm，层间距 0.1 mm，Hor.FOV 28 mm，Vent.FOV 28 mm，翻转角 90°，矩阵192×192，激励次数12；扫描完成后导出图像用Image J软件进行分析。

3.5 取材、免疫荧光、尼氏染色和TUNEL 染色 pMACO 模型后24 h 过量麻醉处死动物，用4 ℃预冷生理盐水快速灌注，然后用4%多聚甲醛灌注固定，OTC 包埋。根据 The Mouse Brain（Paxinos-Watson）图谱选取冠状位层面进行冰冻切片，层厚30 μm。将切片脱OTC、洗涤和通透后按DAPI、尼氏染色及TUNEL染色的具体操作步骤均按照相关试剂盒说明书严格执行。选取皮层梗死半暗带区进行神经元细胞计数，每个标本选取200×倍镜下5 个不同视野进行计数。

3.6 Western blot 提取皮层组织总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白总浓度后与5×loading buffer 混合变性，每孔取 20 μg 蛋白上样，进行电泳和转膜，TBST 溶液清洗后，加入 5% BSA 溶液室温下封闭 1 h，TBST 溶液清洗3 次后，加入Ⅰ抗（TFEB、LAMP-1、caspase-3和 LC3-Ⅱ抗体1∶1 000 稀释，β-actin 抗体 1∶2 000 稀释），于4 ℃摇床中孵育过夜，加TBST 振洗后加入HRP 标记羊抗兔Ⅱ抗（稀释倍数1∶2 000），室温孵育1 h，TBST 清洗3 次后，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以ImageJ 软件分析计算各组蛋白的相对表达量。

4 统计学处理

实验数据采用SPSS 25.0 软件分析。计量资料表示方法为均数±标准差（mean±SD），对数据进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性的两组间数据分析采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 脑组织血流灌注

PeriCam PSI 血流灌注量可用灌注量单位（PU）表示。结果显示pMCAO 前左右两侧血流分布对称，pMCAO 后梗死侧相应区域血流灌注量显著下降（P＜0.01），图像颜色由红色变为淡黄色甚至蓝色，说明造模成功，并以此为标准，造模成功小鼠纳入组别进行后续分析，见图1。

Figure 1.The blood perfusion in the brain significantly decreased after pMCAO.The scale bar=1 cm.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs baseline.图1 pMCAO后梗死侧血流灌注显著下降

2 相关蛋白表达水平随pMCAO时间延长改变

随着pMCAO 梗死时间的延长，TFEB 与LAMP-1的蛋白表达量都随之下降，各梗死时间段下降幅度均有统计学差异（P＜0.05），且在p-MCAO-24 h 组差异最大，自噬体膜型LC3B-Ⅱ在各梗死时间段均有下降趋势（P＜0.05），各组Pro-caspase-3 与cleaved caspase-3 表达均升高（P＜0.05），caspase-3 活化比例在各组均有上升趋势，在pMCAO-8 h 组较假手术组比较具有统计学差异（P＜0.05），见图2。

Figure 2.The time-dependent changes of TFEB，LAMP-1，LC3B and caspase-3 levels from 2 h to 24 h after pMCAO.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs sham group.图2 皮层神经元TFEB、LAMP-1、LC3B和caspase-3蛋白在不同pMCAO梗阻时间的表达情况

3 侧脑室注射AAV9 能稳定转染目的基因至皮层神经元，增加或抑制TFEB的表达

免疫荧光显示各组皮层神经元内GFP 荧光明亮，越靠近脑室区越明显（图3A）；Western blot 结果显示AAV9-TFEB 组TFEB 总体表达增高、入核增多（P＜0.05），而AAV9-shTFEB 组TFEB 表达减少、入核显著减少（P＜0.01），见图3。

Figure 3.Overexpression or knockdown of TFEB introduced by AAV9.A：the cortical neurons infected by AAV9（scale bar=100 μm）；B：nuclear and cytoplasmic expression of TFEB in the brain tissue.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs AAV9-NC group.图3 经AAV9介导的脑组织过表达或敲减TFEB的效果

4 各组神经功能学评分及MRI梗死情况

AAV9-TFEB 组神经功能缺损评分为2.11±0.78，低 于 AAV9-NC 组 的 3.00±0.70（P＜0.05）；AAV9-shTFEB 组神经功能缺损评分为3.67±0.50，高于 AAV9-shNC 组的 3.0±0.50（P＜0.05）。MRI 结果显示与 AAV9-NC 组（0.73±0.11）相比，AAV9-TFEB 组的梗死区域体积比（0.51±0.14）显著减少（P＜0.01）。AAV9-shTFEB 组（0.89±0.06）与AAV9-shNC 组（0.76±0.12）相比梗死区域体积比增大（P＜0.01）。见图4。

Figure 4.The effects of overexpression or knockdown of TFEB on neurologic score and infarct volume after pMCAO.A：TFEB overexpression reduced neurologic deficit score；B：TFEB overexpression reduced infarct volume；C：knockdown of TFEB aggravated neurologic deficit score；D：knockdown of TFEB increased infarct size.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs AAV9-NC group；#P＜0.05 vs AAV9-shNC group.图4 过表达或敲减TFEB对小鼠神经功能和脑梗死体积的影响

5 细胞存活情况及凋亡情况

尼氏染色结果显示绿色箭头为正常神经元，神经元排列规律，整体蓝染，尼氏小体呈深蓝色粗大紧密的颗粒。红色箭头为变性、坏死神经元，神经元排列紊乱，尼氏小体减少，甚至消失，整体呈淡染状态。AAV9-TFEB 组缺血半暗带区正常神经元细胞数为104.80±1.58，显著多于 AAV9-NC 组的 69.17±2.40（P＜0.01）；AAV9-shTFEB 组缺血半暗带区正常神经元细胞数为51.33±2.45，显著少于AAV9-shNC 组的71.50±2.23（P＜0.01），见图 5。TUNEL 检测结果显示AAV9-TFEB 组缺血半暗带区细胞凋亡率为（5.74±0.16）%，显著少于 AAV9-NC 组的（13.00±0.28）%（P＜0.01）；AAV9-shTFEB 组缺血半暗带区细胞凋亡率为（21.40±0.34）%，显著高于AAV9-shNC组的（12.83±0.53）%（P＜0.01），见图6。

Figure 5.The results of Nissl staining.The green arrow points to normal neurons，while the red arrow points to damaged neurons.The scale bar=50 μm.A：TFEB overexpression；B：TFEB knockdown.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs AAV9-NC group；##P＜0.01 vs AAV9-shNC group.图5 皮层尼氏染色结果

Figure 7.The protein levels of TFEB，LAMP-1，LC3B and cleaved caspase-3 in cortical neurons with TFEB overexpression were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs AAV9-NC group.图7 TFEB过表达对pMCAO后皮层神经元TFEB、LAMP-1、LC3B和cleaved caspase-3蛋白水平的影响

Figure 8.The protein levels of TFEB，LAMP-1，LC3B and cleaved caspase-3 in cortical neurons with TFEB knockdown were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs AAV9-shNC group.图8 敲减TFEB对pMCAO后皮层神经元TFEB、LAMP-1、LC3B和cleaved caspase-3蛋白水平的影响

6 过表达及敲减TFEB对pMCAO后皮层神经元细胞LAMP-1、LC3B和cleaved caspase-3表达的影响

AAV9-TFEB 转染皮层神经元后促进TFEB 的表达（P＜0.05）。AAV9-TFEB 转染使pMCAO 后皮层神经元细胞自噬和溶酶体功能增强（LC3B-Ⅱ及LAMP-1 表达增多），并使cleaved caspase-3 活化比例显著减少（P＜0.05），见图7。AAV9-shTFEB 转染皮层神经元后降低TFEB 的表达（P＜0.05）。AAV9-shTFEB 转染使pMCAO 后皮层神经元细胞自噬和溶酶体功能进一步减弱（LC3B-Ⅱ及LAMP-1 蛋白表达减少），并使 cleaved caspase-3 活化比例显著增高（P＜0.05），见图8。

讨 论

脑卒中以缺血性卒中为主，目前除了溶栓与取栓，仍然没有特别有效的治疗手段，并且溶栓与取栓受时间窗限制也难以使绝大部分患者受益。因此，充分认识缺血性卒中的发病机制并做相应干预对缺血性卒中的治疗至关重要。缺血性卒中后神经元死亡的机制十分复杂，在脑梗死中央区绝大部分神经元发生急性坏死，而在缺血半暗带区神经元则发生程序性坏死、凋亡和自噬等，其中自噬与凋亡是左右缺血性损伤后神经元预后的主要方式。自噬是一个高度依赖溶酶体功能的分解代谢过程，它在维持细胞内稳态中起着重要作用，如果自噬功能障碍，则可能引起感染、癌症、神经退行性变、心血管疾病和衰老等疾病的发生与发展。自噬对细胞的存活具有双向作用［12］，在缺血性损伤中，适度的自噬具有保护作用［13-14］，而自噬的过度激活则可能导致细胞死亡［15］，因此，在脑缺血过程中充分认识自噬的变化并调控自噬及溶酶体功能或许能成为治疗缺血性脑卒中的一个重要切入点。Caspase 家族是脑缺血损伤后神经元凋亡的重要调节器，在脑缺血损伤中caspase 家族明显被活化，。在众多的caspase 家族成员中，caspase-3是细胞凋亡主要的参与者，在缺血性脑损伤中caspase-3 明显升高［16］。因此，抑制 caspase-3 的活化也是减少缺血性脑损伤的关键所在。

TFEB 是调节自噬及溶酶体功能的重要因子，它是小眼畸形相关转录因子/转录因子E（microphthalmia-associated transcription factor/transcription factor E，MiTF/TFE）家族成员，通过同源或异源二聚体的形式与DNA 结合，识别启动子E-box、M-box 启动相应基因的转录，发挥调控作用。TFEB 作用广泛，可参与多种疾病的病理生理过程，已经被认为是改善肾脏疾病、神经元退行性病变和动脉粥样硬化等疾病的潜在靶点［17-19］。本研究结果显示在小鼠pMCAO模型中随着梗阻时间的延长，梗死侧皮层神经元TFEB 表达逐渐下降，并伴随着自噬及溶酶体功能障碍、凋亡关键执行分子caspase-3活化增加，表明自噬及溶酶体途径的确参与缺血性神经元损伤的发生发展。我们后续利用AAV9 过表达皮层神经元TFEB可使小鼠pMCAO 后脑梗死体积缩小、神经功能改善，主要机制是TFEB 过表达恢复了pMCAO 后自噬及溶酶体功能，增强了对受损细胞器及有害大分子的清除，减少了caspase-3的活化，从而减轻了神经元凋亡，减轻了神经元损伤。我们通过敲减皮层神经元TFEB进行进一步验证，结果显示TFEB敲减后自噬及溶酶体功能障碍加重，caspase-3 活化增加，小鼠神经功能缺损愈加严重，脑梗死体积比也均显著增加，与TFEB过表达组结果相比呈相反趋势。

综上所述，TFEB 调控的自噬及溶酶体功能参与了小鼠缺血性卒中神经元损伤的发生发展，过表达皮层神经元TFEB 可通过激活自噬及溶酶体功能减轻缺血性卒中诱导的神经元凋亡，改善神经功能。