海马齿状回的内质网应激参与AD模型大鼠空间学习记忆损伤的机制*

肖 斌， 任 鹏， 李明月， 金清华

（延边大学医学院生理与病理生理学教研室，吉林延吉133002）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是以进行性认知功能下降为主要特征的中枢神经系统退行性疾病，而作为学习记忆功能关键部位的海马是AD进程中受影响最早且最严重的脑区［1］。海马神经元具有高度发达的内质网，与神经元内蛋白质合成及细胞内Ca2+稳态维持等密切相关。当各种原因导致神经元内稳态失衡时，大量非折叠（或错误折叠）蛋白在内质网堆积将诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），而后者导致海马神经元内Ca2+相关信号的紊乱［2］。文献报道，AD 患者海马中可见ERS 标志性蛋白，包括葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulated protein 78，GRP78）和磷酸化的蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）等表达升高［2］。众所周知，脑内神经元β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积是AD 的主要病理表现，研究发现，Aβ 可诱发海马神经元的ERS［3］，而后者不仅加重Aβ的错误折叠，还通过促进神经原纤维缠结及神经元过量凋亡等［4］AD样病理改变参与AD 的认知障碍，提示ERS可能成为AD 认知功能损伤的潜在药物作用靶点，需要进一步探究海马内ERS参与认知障碍的下游信号通路。

哺乳动物的海马主要分为CA1、CA3 及齿状回（dentate gyrus，DG），其中，DG 区作为海马与外界联系的关键部位对编码空间信息非常重要［5］。突触传递效应的长时程增强（long-term potentiation，LTP）是海马突触可塑性的主要形式，也是海马参与学习和记忆的重要机制。海马DG 区LTP 的形成和维持依赖于突触后膜NMDA 受体的激活及随后的Ca2+信号转导［6］。钙调蛋白（calmodulin，CaM）和Ca2+/CaM 依赖性蛋白激酶II（Ca2+/CaM-dependent protein kinase II，CaMKII）是海马神经元内Ca2+信号的关键效应器蛋白，LTP 的形成和维持依赖于其持续的磷酸化激活［7］。不仅如此，CaMKII能够与神经元内游离Ca2+结合、传导Ca2+信号，其中细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是细胞内CaMKII 的重要作用靶点之一，而ERK 被CaMKII 磷酸化激活后由胞质转位到细胞核，介导LTP 相关功能蛋白，如脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的转录［8-9］，后者对 LTP 的形成和维持具有重要调节作用［10］。本课题组先前的研究也证明，海马DG 区的BDNF 参与空间学习相关LTP 的产生过程［11］。AD 认知障碍包括对空间认知障碍，且研究报道激活正常动物体内ERS 可直接损伤动物的空间相关学习和记忆功能［12］。虽然这些文献提示AD海马DG 区的ERS可能参与空间学习和记忆障碍，但其是否通过改变CaMKII/ERK 信号途径及下游的BDNF表达参与空间认知功能障碍尚无定论。因此，本研究以海马DG 为研究对象，通过4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）阻断 ERS，探讨海马 DG区ERS在AD 空间学习记忆功能损伤中的作用机制，为以ERS为靶点的AD药物研究提供实验依据。

材料和方法

1 动物

3 月龄雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，250～280 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号为SCXK（辽）2015-0001。大鼠饲养环境为自由进食饮水，自然光照，室温20～25 ℃。动物实验方案经延边大学动物伦理委员会批准。

2 主要试剂

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）和 4-PBA 购自 Sigma；ERK 通路抑制剂PD98059购自MCE。上述试剂均溶解于生理盐水（normal saline，NS）。兔抗大鼠BDNF、PERK、磷酸化PERK（phosphorylated PERK，p-PERK）、ERK、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、CaMKII、磷酸化 CaMKII（phosphorylated CaMKII，p-CaMKII）、β-actin和GRP78抗体及辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG II 抗购自 Cell Signaling Technology；ECL 显影液购自Millipore。

3 主要方法

3.1 AD 大鼠模型的制备和实验分组 AD 大鼠模型的制备方法如下：腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉大鼠，固定于脑立体定向仪上，大鼠头顶部正中做切口，参照《大鼠脑立体定位图》于大鼠双侧侧脑室（以前卤为原点，旁开1.4 mm，后0.8 mm，深3.6 mm 处）微量注射STZ（2.4 mg/kg），速度为0.5 μL/min，注射后留针5 min，完成注射后恢复3 d，以后每天腹腔注射D-Gal（60 mg/kg），共6 周；空白对照（control）组大鼠用等体积生理盐水代替STZ 和DGal。本实验中动物分3 个部分进行实验：（1）分为control 组（n=6）和AD 组（n=6），主要观察大鼠海马DG 区超微结构和 ERS 标志蛋白表达；（2）分为 control+NS 组（n=10）、AD+NS 组（n=10）和 AD+4-PBA 组（n=10），在6 周的AD 大鼠模型制备期结束后，每天腹腔注射相应体积的NS或4-PBA（40 mg/kg），共7 d，观察大鼠的空间学习和记忆能力，以及海马DG 区CaMKII、ERK 和 BDNF 的水平；（3）AD 模型大鼠随机分为对照（AD+NS+NS）组（n=6）、阻断 ERS（AD+4-PBA+NS）组（n=6）和阻断 ERS+ERK（AD+4-PBA+PD98059）组（n=6），在6 周的AD 大鼠模型制备期结束后，每天分别腹腔注射相应体积的NS、4-PBA（40 mg/kg）或 4-PBA（40 mg/kg）+PD98059（3 mg/kg），共 7 d，观察大鼠海马DG区ERK和BDNF的表达。

3.2 Morris 水迷宫 Morris 水迷宫主要由圆形水池（直径为1.8 m，水深0.4 m，水温22 ℃）、圆形站台（直径为0.12 m，固定于第三象限）和视频记录系统组成。实验前大鼠进行适应性游泳1次（淘汰先天愚或其他因素导致不会游泳的大鼠）。正式实验分为定位航行实验和空间探索实验。（1）定位航行实验：每天在相同时间段进行，共4 d，记录大鼠从入水到完全爬上隐藏在水下站台所用的时间（即逃避潜伏期）和游泳的速度，以此来衡量大鼠的空间学习能力。具体训练方法为：每只大鼠每天按照I～IV 象限的顺序分别从4个象限的入水点将大鼠放入水池中，每只大鼠的游泳时限为120 s，如果大鼠在120 s内找到站台并站立其上10 s，则大鼠的逃避潜伏期记录为找到站台的时间；若大鼠120 s 内未找到站台，需要引导大鼠到站台上站立10 s ，此时逃避潜伏期记为120 s。（2）空间探索实验：Morris水迷宫训练的第5天撤去站台，记录大鼠在120 s 内穿越原站台区的次数和在目标象限（站台所在象限）的时间（相同时间段内进行），以此来衡量大鼠的空间记忆能力。

3.3 透射电子显微镜检测法 麻醉状态下处死大鼠，冰上分离各组大鼠海马DG 组织（左侧用于透射电镜检测，右侧备用于Western blot 分析）。组织固定于冷2.5%戊二醛中，磷酸缓冲液清洗，1%锇酸再次固定后梯度脱水，纯丙酮+包埋液（2∶1）室温包埋4 h，37 ℃烘箱内烘烤过夜，超薄切片机制备50 nm 切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察海马的突触和内质网结构。

3.4 Western blot 实验 右侧海马DG 组织于冰上，加入裂解液（含PMSF和蛋白磷酸酶制剂混合物），充分匀浆后离心取上清液；BCA 法测定蛋白浓度；电泳条件为恒压90 V，转膜条件为4 ℃，恒压90 V；5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗3次后加入I抗（β-actin 抗体 1∶2 000 稀释，GRP78、PERK、ERK、CaMKII、p-CaMKII、p-PERK、p-ERK 和 BDNF 抗体均 1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤，II抗（1∶2 000稀释）孵育2 h；加入ECL显影液，暗室内胶片曝光、扫描。

4 统计学处理

用SPSS 18.0 统计软件进行分析。数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。两样本的均数比较采用独立样本t检验；多组样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 校正t检验。P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

结 果

1 AD大鼠海马DG区的突触和内质网结构的变化

透射电镜观察可见，control 组大鼠海马DG 区神经元内突触结构完整，突触间隙清晰，膜上有明显的突触致密结构（图1Aa），粗面内质网排列整齐、密集（图1Ab）；AD 组大鼠突触结构损伤、边界不清，无突触间隙和致密区等结构（图1Ba），内质网排列疏松，表面附着的核糖体脱落（图1Bb）。

Figure 1.Neuronal ultrastructure in the hippocampal DG under transmission electron microscope.A：control group；B：AD group.Arrows denote the synapse（a）and endoplasmic reticulum（b）.The scale bar=100 nm.图1 透射电镜下大鼠海马DG区神经元的超微结构

2 AD大鼠海马DG区ERS相关蛋白的变化

Western blot 法检测大鼠海马 DG 区 ERS 活化的主要标志蛋白GRP78 的水平，及内质网跨膜信号蛋白PERK 的自身磷酸化，结果显示，AD 大鼠海马DG区GRP78和p-PERK的水平均升高，与control组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

Figure 2.Expressions of GRP78 and p-PERK in the hippocampal DG.A：the protein level of GRP78 was normalized to the level of beta-actin；B：the protein level of p-PERK was normalized to the level of PERK.Mean±SEM. n=4.*P＜0.05 vs control group.图2 海马DG区GRP78和p-PERK蛋白水平的比较

3 阻断海马DG 区ERS对AD大鼠空间学习能力的影响

通过Morris 水迷宫实验评估大鼠的空间学习记忆能力，结果显示，与control+NS组大鼠相比，AD+NS大鼠的逃避潜伏期在训练的第2、3 和4 天均显著增加（P＜0.05）；而阻断海马DG 区ERS（AD+4-PBA 组）的大鼠的逃避潜伏期在训练的第4 天显著缩短（P＜0.05），见图3A。此外，定位航行实验期间各组大鼠平均游泳速度的差异无统计学显著性（P＞0.05），见图3B。这提示阻断AD 大鼠海马DG 区ERS 反应能够缓解AD 相关空间学习能力的损伤，而这种作用与大鼠的游泳速度即运动能力的强弱无关。

Figure 3.The spatial learning abilities of the rats in each group.The escape latency（A）and swimming speed（B）in place navigation trial of Morris water maze test were shown.Mean±SEM. n=10.*P＜0.01 vs control+NS group；#P＜0.05 vs AD+NS group；@P＜0.05 vs day 1.图3 各组大鼠空间学习能力的比较

4 阻断海马DG 区ERS对AD大鼠空间记忆能力的影响

Morris 水迷宫空间探索实验结果如图4 所示。与control+NS 相比，AD+NS 大鼠穿越原站台区的次数及其在目标（站台）象限的游泳时间显著减少（P＜0.05）；而与 AD+NS 组相比，阻断海马 DG 区 ERS 的AD+4-PBA 组大鼠穿越原站台区的次数及其在目标（站台）象限的游泳时间均显著增加（P＜0.05）。

Figure 4.The spatial memory abilities of the rats in each group.The number of platform crossings（A）and time in each quadrant（B）in spatial probe trial of Morris water maze test were shown.Mean±SEM. n=10.*P＜0.05 vs control+NS group；#P＜0.05 vs AD+NS group.图4 各组大鼠空间记忆能力的比较

5 阻断ERS对AD大鼠海马 DG区CaMKII/ERK/BDNF通路相关蛋白表达的影响

如图5所示，与 control+NS 相比，AD+NS 组海马内p-CaMKII、p-ERK和BDNF 的蛋白水平均显著降低（P＜0.05）；与AD+NS 组比较，阻断ERS的AD+4-PBA 组大鼠海马 DG 区内 p-CaMKII、p-ERK 和 BDNF的蛋白水平均显著升高（P＜0.05），提示AD大鼠海马DG 区出现的 ERS 反应可抑制 CaMKII/ERK/BDNF 通路的活化。

Figure 5.The protein levels of p-CaMKII（A），p-ERK（B）and BDNF（C）in the hippocampal DG.The protein levels of p-CaMKII and p-ERK were normalized to the levels of CaMKII and ERK，respectively，and BDNF was normalized to β-actin.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs control+NS group；#P＜0.05 vs AD+NS group.图5 海马DG内p-CaMKII、p-ERK和BDNF蛋白的表达

6 阻断 ERK对 AD大鼠海马DG内BDNF蛋白表达的影响

与AD+NS+NS 组比较，AD+4-PBA+NS 组大鼠海马DG 区p-ERK 和BDNF的蛋白水平均显著升高（P＜0.05）；与 AD+4-PBA+NS 组比较，阻断 ERK 活化的AD+4-PBA+PD98059 组大鼠的海马 DG 区 p-ERK 和BDNF的蛋白水平均显著降低（P＜0.05），见图6。

讨 论

AD 是一种与衰老相关的进行性中枢神经系统退行性疾病。双侧侧脑室注射STZ 能够诱导出胆碱能神经元丢失，神经元内、外沉积Aβ 斑块和过度磷酸化的Tau 蛋白形成的神经原纤维缠结等AD 样典型病理改变［13］，并诱发突触功能障碍及认知功能渐进性损伤［9］。腹腔注射D-Gal 能够加速衰老，是研究衰老相关脑认知障碍的主要手段［14］。双侧侧脑室注射STZ 联合腹腔注射D-Gal是目前公认的、可较好地模拟AD 病变下认知功能损伤的、散发性AD 动物模型的制备手段之一，因此，本研究通过1 次双侧侧脑室注射STZ联合6周腹腔注射D-Gal方法制备了散发性AD 大鼠模型。本研究结果显示，AD 大鼠海马DG区出现突触结构损伤以及内质网结构紊乱，这与AD患者的海马内超微结构损伤类似［2］。内质网的结构或功能紊乱能够诱发ERS，后者主要由内质网的分子伴侣蛋白GRP78 和内质网的3 个跨膜蛋白介导，其中跨膜蛋白PERK 的自身二聚化和磷酸化激活能够诱发下游级联通路，进一步加重ERS 反应，损伤突触功能，与AD 病变密切相关［15-16］。研究发现，在 AD患者的脑内GRP78 和p-PERK 等ERS 相关因子表达显著增多［2］，且在APP/PS1和3XTg转基因小鼠中，也可看到较高水平的GRP78 和PERK 等因子的活化［17-18］。与之相似，本研究结果也显示，双侧侧脑室注射STZ 联合长期腹腔注射D-Gal 诱发的散发型AD模型大鼠中，海马DG 区的GRP78 和p-PERK 的蛋白水平显著增加，提示AD 大鼠海马DG 区出现了ERS反应。如前所述，海马DG 区作为新信息进入海马的传入点，在空间学习和记忆中起关键作用。为明确ERS 在AD 的空间学习和记忆损伤中的作用，本研究利用4-PBA阻断ERS后，通过Morris水迷宫实验评估了AD 大鼠的空间学习记忆功能。4-PBA 是一种短链芳香族脂肪酸，作为ERS 常用抑制剂，它在细胞内扮演分子伴侣的角色，可稳定蛋白质构象，逆转蛋白质的错误定位和（或）聚集，并缓解ERS 诱发的非蛋白折叠反应［19-20］。本研究结果显示，利用4-PBA 阻断ERS能够明显缓解AD大鼠的空间学习和记忆损伤。

众所周知，LTP 是海马参与学习和记忆功能的重要机制之一，而学习记忆相关LTP 的产生和维持依赖于神经元内的信号级联转导及功能蛋白质的合成［21］。在大鼠海马 DG 区，NMDA 受体激活引起的细胞内Ca2+大量增加是LTP 产生的触发步骤，而Ca2+通过激活CaMKII 诱发的各种级联反应，如AMPA 受体磷酸化及移位、一氧化氮合酶激活、ERK 磷酸化激活、BDNF表达增加等，对海马DG区LTP的产生和维持起到关键作用［7-9，22］。ERK 是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）家族的重要成员，ERK 在神经元内被磷酸化激活后由胞质转位到细胞核，通过介导BDNF 的合成参与调节突触效应，影响学习记忆功能［23］。近些年，ERK 在 AD 的发病机制中的作用也逐渐受到人们的关注。研究发现，在AD 发病早期，ERK 可直接被神经元外沉积的Aβ 激活，并参与诱导tau 蛋白过度磷酸化、神经元凋亡等 AD 相关病理损伤［24-26］；而后随着 AD 病程的进展，ERK 逐渐呈抑制状态［24］，而 ERK 活性的抑制直接参与损伤海马相关的空间学习和记忆功能［27］。BDNF 不仅影响脑内神经元的生长、分化和存活，也是海马学习、记忆和突触可塑性调节的重要蛋白［28］，我们先前的研究也表明，海马DG 区的BDNF 参与调节空间学习和记忆过程中的LTP［10］。如前所述，内质网与细胞内钙稳态维持有密不可分的关系，而ERS可导致神经元内Ca2+相关信号的紊乱。因此，为了探讨AD 海马DG 区的ERS 直接影响CaMKII 及其下游信号并损伤空间学习和记忆的可能性，本研究观察了 4-PBA 阻断 ERS 对海马 DG 区 CaMKII 和 ERK磷酸化激活和BDNF 蛋白水平的影响。结果显示，AD 大鼠海马 DG 区 p-CaMKII、p-ERK 和 BDNF 的蛋白水平显著降低，而阻断ERS 可提高AD 大鼠海马DG区p-CaMKII、p-ERK和BDNF的蛋白水平。

为了进一步验证海马DG 区ERS 是否通过抑制CaMKII/ERK/BDNF 通路参与AD 大鼠的空间学习和记忆损伤，本研究在抑制ERS 基础上利用PD98059抑制 ERK 磷酸化，观察 AD 大鼠海马 DG 区 BDNF 的变化。PD98059 是常用的 ERK 抑制剂［29］，能够特异性地阻断ERK 磷酸化而不影响其他MAPK 家族通路。本研究结果发现，PD98059 阻断了ERS 抑制剂4-PBA 引起的 AD 海马 DG 区 p-ERK 和 BDNF 蛋白水平的增加，提示海马DG 区ERS 相关的AD 空间学习和记忆功能损伤与ERK活性抑制有关。

综上所述，海马DG 区ERS 可损伤侧脑室注射STZ 联合长期腹腔注射D-Gal 诱发的散发型AD 模型大鼠的空间学习和记忆功能，而阻断ERS 能够缓解其空间学习和记忆功能损伤，这与CaMKII/ERK/BDNF分子通路的反应增强有关。