纳米TiO2对幼年小鼠血浆代谢谱影响的代谢组学研究

姬海南，李海山，宋乃宁，赵潺，李文涛，徐宝梁，沈国林

中国检验检疫科学研究院化学品安全研究所，北京 100123

TiO2(titanium dioxide, TiO2)，俗称“钛白粉”，在食品工业中常作为着色剂用于口香糖、糖果、甜点和沙拉酱等食品[1-2]。相比于常规TiO2，纳米TiO2具有粒径小、白色度高，并可以提高营养物质的吸收率，故纳米TiO2已被广泛开发应用于食品产业链的各个环节[3-4]。体内研究表明，纳米TiO2可以通过皮肤、呼吸系统和消化道等途径进入体内，对机体产生毒性[5-6]。纳米TiO2可以使小鼠脑组织中的胶质细胞过度增殖同时伴有脑出血现象，并且脑组织出现氧化应激反应[7]。纳米TiO2导致大鼠肝脏和肾脏组织出现细胞凋亡以及DNA损伤[8]。目前，纳米TiO2的毒性研究主要集中在环境污染物中纳米TiO2的肺部吸入是否会导致肺部炎症和哮喘，及从消化道摄入是否会导致克罗恩病和癌症的发生[9-10]。有报道指出，儿童每天通过食品摄入体内的纳米TiO2量在美国达到2 mg·kg-1bw，而在英国可达3 mg·kg-1bw，约为成年人每日摄入量的3倍～5倍[11-12]。由于，儿童的肠道功能尚未健全，屏障功能弱，纳米食品添加剂对其影响更加严重[13-14]。这使得纳米TiO2对婴幼儿带来的安全隐患不断增大，人们应当对纳米TiO2的生物安全性予以重视。

代谢组学研究关注的是生物体系受到外在和内在因素刺激下所导致的内源性代谢产物的变化，可以对那些能够揭示和描述代谢循环情况的关键内源性物质进行定性或定量的分析。血液中含有多种代谢物，能够较为全面反映生物体的代谢状况[15]，且血浆样品的收集方便等特点使操作简便易行。本研究利用代谢组学技术研究经口摄入纳米TiO2对小鼠血浆代谢谱的影响，寻找与纳米TiO2相关的生物标志物，揭示小鼠体内可能受到影响的代谢途径，以期为进一步阐明纳米TiO2对机体的毒性作用机制奠定基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

DV215CD型电子分析天平(德国赛多利斯公司)，MS304TS/02型电子天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)，88 700V型-80 ℃冰箱(赛默飞世尔科技有限公司)，UltiMate 3000型超高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，Q-Exactive型高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，Waters C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)色谱柱(美国沃特世公司)，Milli-QAdvantageA10型超纯水仪(美国Millipore公司)，X-30R型离心机(美国西格玛奥德里奇公司)，乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵均为色谱纯，购于赛默飞世尔科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

ICR幼年小鼠，雌性，周龄3～4周，体质量约10 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，小鼠饲养于SPF级动物房中，适应性饲养一周后按体质量随机分为对照组和纳米TiO2染毒组。该实验经中国检验检疫科学院化学品安全研究所动物伦理委员会批准，4%的异氟烷麻醉取血，二氧化碳麻醉处死，实验前禁食24 h，自由饮水。

1.3 染毒实验

小鼠适应性饲养结束后，设置1个空白对照组和4个染毒剂量组，每组15只，染毒剂量分别为10、30、100和300 mg·kg-1，每天灌胃染毒一次，连续染毒28 d。末次染毒后，4%的异氟烷麻醉取血，于含有肝素钠的2 mL无菌离心管中3 500 r·min-1离心10 min，取血浆冻存于-80 ℃冰箱。二氧化碳麻醉处死，取心、肝、脾和肺等脏器称量质量，并计算脏器系数(脏器系数=脏器质量/动物体质量×100%)。

1.4 血浆样品的高分辨质谱检测[16]

分析前将血浆样品于4 ℃冰箱中解冻，取50 μL，加入沉淀剂(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)450 μL(含正内标普萘洛尔10 ng·mL-1和负内标甲苯磺丁脲50 ng·mL-1)，涡流30 s，涡旋混匀60 s，13 000 r·min-1离心10 min，吸取100 μL采用高分辨质谱仪QE-Orbitrap进行检测。色谱流动相：A为乙腈，B为水(含0.1%甲酸及2 mmoL·L-1甲酸铵)；梯度洗脱：0～1 min，5% A；1～5 min，5%～60% A；5～8 min，60%～100% A；8～11 min，100% A；11～14 min，100%～60% A；11～15 min，60%～5% A；15～18 min，5% A；柱温30 ℃，流速0.25 mL·min-1，进样量5 μL，进样盘温度4 ℃。在电喷雾离子源(ESI)正负离子模式下采集数据，喷雾电压3 kV；蒸发温度350 ℃；毛细管温度320 ℃；S-lens RF为50；一级全扫描(full scan)的分辨率为70 000，扫描范围为70～1 050 (m/z)。二级数据依赖性扫描(full MS/dd-MS2)：分辨率为17 500；AGC target为1e5；Maximun TT为50 ms；NCE为20、40和60。

1.5 小鼠血浆胆汁酸含量的检测[17]

小鼠血浆50 μL加入含内标的(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)沉淀剂450 μL，涡旋混匀60 s，13 000 r·min-1离心10 min，吸取100 μL进行测定，胆汁酸检测色谱条件：A为水(含0.1%甲酸)，D为乙腈；梯度洗脱，梯度洗脱程序为0～0.5 min，30% D；0.5～2.5 min，30%～60% D；2.5～4.0 min，60%～95% D；4.0～6.0 min，95% D；6.0～6.1 min，95%～30% D；6.1～8.0 min，30% D，分析时间0～8 min，每次进样5 μL，流速为0.3 mL·min-1。色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18 (3 μm，2.1 mm×100 mm)，色谱柱温度为30 ℃，自动进样器的温度保持在4 ℃。胆汁酸检测在电喷雾离子源(ESI)负离子SIM模式下采集数据，喷雾电压为2 500 V；蒸发温度为350 ℃；鞘气为40 Arb；辅助气为10 Arb；毛细管温度为350 ℃；S-lens RF为50。胆酸(CA)为407.28030、脱氧胆酸(DCA)为391.28538、熊脱氧胆酸(UDCA)为391.28538和牛磺胆酸(TCA)为514.28440。

1.6 代谢通路分析

根据文献方法鉴定内源性代谢物和处理数据(图1)[18]。利用Metaboanalyst 4.0分析对照组与纳米TiO2不同染毒剂量组小鼠血浆内源性代谢物的差异，找出VIP值>1的内源性代谢物，绘制主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squared discriminant, PLS-DA)以及拓扑分析图，再利用MetaboAnalyst 4.0网站中的Pathway Analysis分析纳米TiO2影响血浆的代谢通路，选择Impact值>0.1的代谢通路作为纳米TiO2影响血浆的主要代谢通路。

1.7 统计学分析

采用Metaboanalyst 4.0进行主成分分析、偏最小二乘判别分析以及拓扑分析，同时分析Impact值>0.1的作为纳米TiO2影响血浆的主要代谢通路。相关数据采用SPSS16.0软件进行数据分析，试验数据用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，数据比较采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各实验组之间的差异，再用Tukey’s test比较各实验组与对照组之间的差异，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 纳米TiO2对ICR幼年小鼠精神状况、饮食量及脏器系数的影响

纳米TiO228 d染毒后，各个染毒剂量组的幼鼠先后出现不同程度的精神萎靡、体质量减轻、进食饮水减少等现象，由表1可知，与对照组比较，随着剂量的增加小鼠的体质量以及心脏、肝脏和肺脏的脏器系数呈下降趋势，说明纳米TiO228 d染毒后可以影响小鼠自身和脏器正常的生理状态，而且影响程度随着染毒剂量的升高而增加。

表1 纳米TiO2对小鼠体质量及脏器系数的影响(Mean±SD, n=10)Table 1 The influence of nano-TiO2 on body mass and viscera coefficient of mice (Mean±SD, n=10)

2.2 血浆总离子图及鉴别方式

采用mzcloud对血浆内源性代谢物质进行鉴定，利用分子式和分子量及二级离子碎片确定内源性物质，同时用TraceFinder软件进行自建内源性物质[19-20]，血浆样品总离子图及鉴别方式如图1所示。

2.3 纳米TiO2对小鼠血浆内代谢的影响

根据文献方法鉴定内源性物质和处理数据(图1)[21]，利用Metaboanalyst 4.0中的Statistical Analysis模块计算PCA和PLS-DA，PCA(图2(a))和PLS-DA(图2(b))结果显示，对照组和纳米TiO2不同剂量染毒组血浆之间都能彻底分开，模型质量参数：Accuracy=0.91，R2=0.93，Q2=0.85，即其中93%的变量被作为建立模型的主要成分，91%的样本符合模型的判别，而模型的预测能力为85%。这表明，幼鼠经不同剂量染毒后，血浆部分内源性代谢轮廓发生改变，从一定程度上说明纳米TiO2能够影响幼鼠机体的代谢轮廓。通过PLS-DA方法对各组的代谢物差异进行分析，选择VIP值>1的内源性物质作为进一步分析纳米TiO2影响血浆代谢通路的种类。由表2可知，血浆中内源性代谢物VIP值>1的总共有49种，其中，31种内源性物质的比例主要是上升，另18种主要呈下降趋势。由表3可知，与对照组相比，各个染毒剂量组中的牛磺胆酸、胆酸、脱氧胆酸和熊脱氧胆酸均升高。以上结果表明纳米TiO2影响了小鼠血浆内源性物质的代谢分泌，使它们的含量发生明显变化。

表2 幼鼠血浆主要差异性标志物的平均变化Table 2 Average changes of major plasma differential markers in young mouse

表3 不同剂量纳米TiO2对血浆胆汁酸浓度的影响(Mean±SD, n=5)Table 3 The changes of bile acid concentration in plasma under the influence of different doses of nano-TiO2(Mean±SD, n=5)

图1 全扫描检测幼鼠血浆总离子流图及缬氨酸鉴别模式识别注：(a)正离子模式下的色谱图；(b)负离子模式下的色谱图；(c)缬氨酸色谱图；(d)缬氨酸相应的精确质量数和分子式。Fig. 1 Full-scan detected total ion maps and valine identification pattern recognition of young mice plasmaNote: (a) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the positive ion scanning; (b) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (c) Valine chromatogram; (d) The exact mass and molecular formula of valine.

图2 高分辨质谱QE-Orbitrap检测的代谢组学数据分析注：(a) PCA模型分析，(b) PLS-DA分析；A为对照组，B为10 mg·kg-1纳米TiO2染毒组，C为30 mg·kg-1纳米TiO2染毒组，D为100 mg·kg-1纳米TiO2染毒组，E为300 mg·kg-1纳米TiO2染毒组。Fig. 2 Analysis of metabonomics data detected by high resolution mass spectrometry QE OrbitrapNote: (a) PCA model analysis, (b) PLS-DA analysis; A represents control group; B represents 10 mg·kg-1 nano-TiO2 group; C represents 30 mg·kg-1 nano-TiO2 group; D represents 100 mg·kg-1 nano-TiO2 group; E represents 300 mg·kg-1 nano-TiO2 group.

2.4 纳米TiO2对小鼠血浆内源性物质代谢通路的影响

如图3和表4所示，血浆内源性物质相关代谢通路受到纳米TiO2影响的主要有6条，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)、花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)、烟酸酯和烟酰胺代谢(nicotinate and nicotinamide metabolism)、组氨酸代谢(histidine metabolism)、醚脂质代谢(ether lipid metabolism)和甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism)等，以上结果说明，纳米TiO2染毒28 d后主要影响小鼠血浆中氨基酸和脂肪酸的合成和代谢，从而导致小鼠血浆中内源性物质含量的变化。

表4 用MetPA构建分析通路结果Table 4 Result from pathway analysis with MetPA

图3 使用MetPA数据库构建重要内源性小分子相关代谢通路Fig. 3 The pathway analysis summary diagram obtained by MetPA

2.5 差异性内源性物质相关性和分层聚类分析

血浆中差异性内源性物质相关性分析结果如图4(a)所示，图中水平轴和垂直轴均代表变量信息，颜色越深反映相关性越强，颜色越浅反映相关性越弱，红色表示正相关，绿色表示负相关，根据图4(a)可知差异性内源性物质之间的相关性。从水平轴看，在同一小分支下的物质的正相关性最强，即某一个物质含量升高或者降低，则与之相关性强的物质会随之升高或降低。分层聚类分析获得的热图如图4(b)所示，图中水平轴和垂直轴分别代表样本与变量信息。颜色深浅反映变量值大小，红色表示含量升高，绿色表示含量降低，颜色越深表明变化量越大，从图4(b)图中可直观看出49种差异性内源性物质在各组间的含量变化趋势。以上结果进一步证明染毒28 d后纳米TiO2影响了小鼠血浆内源性物质含量。

图4 应用相关性分析与分层聚类分析法分析血浆数据Fig. 4 Plasma data were analyzed using correlation analysis and hierarchical clustering

3 讨论(Discussion)

磷脂不仅是细胞膜和各种细胞器(线粒体、内质网和细胞核等)膜的重要组成成分，还参与调节生物体内的许多重要功能，如神经传导、降血脂和降低胆固醇等[22]，由代谢通路拓扑分析结果可知，纳米TiO2影响了小鼠机体的磷脂代谢(Impact值>0.1)。如表2所示，与甘油磷脂代谢通路相关的差异性标志物中，不同剂量染毒引起了细胞内膜主要组成成分磷脂酰胆碱(PCs)及其水解产物溶血磷脂(LysoPCs)发生异常变化，而且随着染毒剂量的增加变化更显著，表明小鼠全身PCs和LysoPCs的代谢发生异常，文献报道溶血磷脂含量的升高会导致细胞膜流动性增强，从而影响膜脂蛋白的有序性，破坏细胞膜结构，进而导致细胞死亡[23]，这表明纳米TiO2对机体的毒性作用可能与LysoPCs的升高有关。此外，细胞外膜的主要组成成分鞘磷脂(SMs)的水平在不同染毒剂量组中均呈现显著升高趋势，表明小鼠全身SMs的代谢降解可能被抑制。与对照组相比，溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPEs)的比例随着染毒剂量的升高均明显降低，表明纳米TiO2可能抑制了全身磷脂酰乙醇胺(PEs)水解生成LysoPEs的反应。以上结果证实了纳米TiO2将影响小鼠磷脂类的代谢。

笔者前期研究发现，纳米TiO2染毒导致部分LysoPCs含量升高，溶血磷脂酰胆碱是磷脂酶A2作用于磷脂酰胆碱的产物，磷脂酰胆碱主要来源是食物和胆汁分泌的磷脂。文献报道健康人每天经胆道分泌大量的磷脂酰胆碱必须经水解释放，最终以溶血磷脂酰胆碱的形式被肠道吸收入血形成肠肝循环[24]，说明胆汁是磷脂类物质主要来源之一。胆汁酸由胆固醇在肝细胞中转化而来，是胆汁的主要成分。其在体内的合成、转运受到多种因素的调节[25]。笔者研究发现，当小鼠暴露于纳米TiO228 d后，与对照组相比，随着染毒剂量的增加血浆中胆酸的比例呈上升趋势(表2)，通过定量检测发现血浆中胆酸、脱氧胆酸、熊去氧胆酸和牛磺胆酸的含量都呈上升趋势(表3)，说明纳米TiO2可以引起肝脏胆汁酸代谢的变化，相关研究表明胆汁酸可以作为生物标识物用来表征肝脏毒性[26-27]，由此推断胆汁酸(胆酸、脱氧胆酸、熊去氧胆酸和牛磺胆酸)可以作为纳米TiO2引起小鼠肝脏毒性的生物标志物。

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