RTCA与CCK-8法用于检测柴油废气颗粒物致支气管上皮细胞毒性的比较研究

谢文静，凌敏，梁婕，范姿，唐萌,#，卞倩,*

1. 东南大学公共卫生学院，南京 210009 2. 江苏省疾病预防控制中心，南京 210009 3. 南京医科大学公共卫生学院，南京 211166

空气污染是一个日益严重的公共卫生问题，造成在世界范围内超300万人过早死亡，这其中的死因包括肺癌、慢性阻塞性肺疾病等相关呼吸系统疾病[1-2]。柴油废气颗粒物(DEP)是空气污染物重要来源之一，由固体碳颗粒物和灰颗粒、挥发性有机化合物和硫化物组成[3]。有证据表明，DEP与呼吸系统相关疾病发生和肺功能损伤有关[4]。也有研究进一步证实，DEP暴露致细胞线粒体功能[5]及氨基酸转运体过表达[6]等。在受到DEP的外来刺激后，支气管上皮细胞(HBE)是第一道接触屏障，产生细胞毒性，引发炎症反应，甚至对细胞存活率产生影响[7]。因此，在DEP致呼吸系统相关疾病的机制研究中，细胞毒性实验是研究的基础和关键。

在检测细胞毒性的方法中，由于实验易于操作且结果易于标准化，通常将2种常规测定方法用于体外细胞毒性评估：Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和实时无标记细胞分析系统(real-time cell analysis system, RTCA)[8]。CCK-8法是一种检测细胞存活和生长情况的经典方法，试剂内的WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜，细胞毒性越大，则颜色越浅，吸光度值越小，对于同一细胞，吸光度值和细胞数目呈线性关系，是常用的检测颗粒物致细胞毒性的传统实验方法。RTCA是一种检测细胞毒性的新技术，是一种建立在阻抗基础上的瞬时细胞电感应连续记录系统，电阻和细胞是否黏附、数量、体积大小及形态变化密切相关，通过检测电阻值进而实时动态监测细胞毒性反应[9-10]。已有文献报道过CCK-8法检测DEP致细胞的毒性[11]，但未见RTCA法检测DEP致肺相关细胞毒性的相关报道。在研究细胞毒性机制方面，RTCA克服CCK-8法定时检测的局限，可以实时监测细胞的状态。因此将这2种方法进行比较，分析RTCA是否能替代传统的CCK-8法。

在本研究中，我们探讨了CCK-8检测DEP致支气管上皮细胞(HBE)的细胞存活率的变化，RTCA法检测DEP致HBE细胞在标准化细胞指数(NCI)值变化，比较2种方法检测结果的差异，并用细胞凋亡实验对结果进行验证。比较这2种方法检测DEP致HBE细胞毒性的结果灵敏度，以及适用范围和局限性，这对接下来研究DEP致呼吸系统相关细胞毒性的机制提供基础。同时，比较了2种DEP致HBE细胞毒性的差异，分析产生差异的原因，为后续的机制研究提供支持。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 药品与试剂

HBE细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所(中国)。柴油废气标准参考颗粒物(货号：Standard Reference Material 1650b (SRM 1650b); Standard Reference Material 2975 (SRM 2975))购自美国国家标准与技术研究院。CCK-8试剂购自上海碧云天公司(中国)。细胞凋亡Annexin V-FITC/PI试剂盒购自南京诺维赞公司(中国)。DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。

1.2 仪器设备

RTCA仪器(xCELLigence RTCA，Agilent，美国)；酶标仪(SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，中国)；流式细胞仪(Accuri C6，BD，美国)

1.3 细胞培养及处理

HBE细胞在37 ℃、5%CO2的条件下培养，培养基为含有10%胎牛血清，1%的青霉素和链霉素的DMEM完全培养基。每2天以1∶3的比例传代细胞。实验使用对数生长期细胞。

1.4 DEP悬液制作

将2种DEP标准品SRM 1650b和SRM 2975在高精度微量天平上称重，分别用Hanks缓冲液混悬制成2 g·L-1的储备悬液。将储备悬液超声处理20 min，制备200 mg·L-1的使用悬液。体外细胞刺激实验前，超声处理使用悬液20 min，并用DMEM培养基稀释至不同的染毒浓度，分别是0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1。

1.5 CCK-8法检测细胞毒性

用CCK-8试剂进行评估细胞毒性的测定。将HBE细胞以1×105cells·mL-1的细胞密度接种到96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μL后，放置在37 ℃、5%CO2的条件下培养24 h。然后吸出孔内培养液，分别加入不同浓度的SRM 1650b和SRM 2975(0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1)，每孔100 μL，以Hanks缓冲液为对照，分次孵育6、12、24和48 h。每个浓度设置3个复孔。最后，向每个孔中加入10 μL CCK-8，在培养箱内孵育2 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。细胞存活率=DEP组吸光度值/Hanks对照组吸光度值×100%。细胞存活率越低，说明DEP对细胞的损伤程度越大。

1.6 细胞种植实验

通过微阵列的电极设计，RTCA测量细胞电极阻抗的变化，将测定的电阻抗实时转化为细胞指数(cell index, CI)，在相同培养条件下，电极上的细胞数量越多，则CI值越大，CI值可实时反映细胞生长状态，进而对细胞状态进行定量。在E-Plate孔板中每孔加50 μL培养基，置RTCA仪器上检测基线，确保所有孔的CI均<0.1。在孔中加100 μL充分混匀的不同浓度的细胞悬液，细胞悬液浓度分别为0.6×105、0.8×105、1×105和1.2×105cells·mL-1。将培养板于超净台中静置30 min，转至37 ℃、5% CO2培养箱中的RTCA仪器上，开始检测，每组3个复孔。

1.7 RTCA法检测细胞毒性

在E-Plate的每孔中加50 μL培养基，置RTCA仪器上检测基线。HBE细胞密度为2×105cells·mL-1，每孔加入细胞悬液50 μL接种于E-Plate孔板中。将孔板放置于RTCA检测仪器20～24 h后，分别加入配制好的SRM 1650b和SRM 2975染毒液50 μL，使每孔最终染毒浓度分别为0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1，于72 h后停止检测，每组3个复孔。比较各组之间的标准化细胞指数(normalized cell index, NCI)。NCI计算方法为将所有组数据在暴露的时间点的CI值设置为分母，所有的CI值为分子，相除得出的值就是NCI值[12]，这可避免各组之间因细胞种板数的差异影响结果。NCI值越低，说明DEP对细胞的损伤程度越大。

1.8 细胞凋亡实验

HBE细胞以1×105cells·mL-1的细胞密度接种到六孔板，每孔加入的悬液体积为2 mL。细胞贴壁后，吸出孔内培养液，分别向每孔加入2 mL的28 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975悬液，将HBE细胞暴露其中6 h；加入2 mL的14 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975悬液，将HBE细胞暴露其中12 h；加入2 mL的14 mg·L-1SRM 1650b和3.5 mg·L-1SRM 2975悬液，将HBE细胞暴露其中24 h；加入2 mL的7 mg·L-1SRM 1650b和3.5 mg·L-1SRM 2975悬液，将HBE细胞暴露其中48 h。用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，进行Annexin V-FITC/PI染色，样品在1 h内用流式细胞仪检测。

1.9 统计学分析

2 结果(Results)

2.1 CCK-8实验结果

分别用0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1的SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE细胞6、12、24和48 h后，进行CCK-8测定。由图1(a)可知，暴露6 h后，与对照组相比，染毒浓度为56 mg·L-1的SRM 1650b组，测得的细胞活性率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；暴露12 h和24 h后，与对照组相比，染毒浓度为28 mg·L-1和56 mg·L-1的SRM 1650b组，测得的细胞活性率均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；暴露48 h后，与对照组相比，染毒浓度为14、28和56 mg·L-1的SRM 1650b组，测得的细胞活性率均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。由图1(b)可知，暴露6 h和12 h后，与对照组相比，染毒浓度为14、28和56 mg·L-1的SRM 2975组，测得的细胞活性率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；暴露24 h和48 h后，与对照组相比，染毒浓度为7、14、28和56 mg·L-1的SRM 2975组，测得的细胞活性率均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法检测柴油废气颗粒物(DEP)致支气管上皮细胞(HBE)细胞存活率的变化注：(a)和(b)分别为CCK-8法检测柴油废气标准参考颗粒物(SRM 1650b和SRM 2975)染毒HBE细胞6、12、24和48 h后致细胞存活率变化；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照相比。Fig. 1 The cell viability of human bronchial epithelial (HBE) cells induced by diesel exhaust particles (DEP) was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assayNote: (a) and (b) show that after DEP Standard Reference Material (SRM 1650b and SRM 2975) induced HBE cells, the changes of cell viability were detected by CCK-8 assay for 6, 12, 24 and 48 h; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control.

2.2 RTCA实验结果

2.2.1 细胞种植实验

将HBE细胞接种于E-Plate 16板中，每组细胞密度分别设为0.6×104、0.8×104、1×104和1.2×104cells·孔-1，设3个复孔，由RTCA实时监测细胞培养72 h的增殖状况。由图2可知，a期为细胞种植后黏附期，b期为对数增长期，c期为平台期，其中整个实验的暴露时间需在对数增长期内。在暴露时间72 h中，细胞密度为0.6×104cells·孔-1和0.8×104cells·孔-1的HBE细胞增长相对平缓，细胞密度为1.2×104cells·孔-1的HBE细胞在60 h后CI值增幅降低，表明细胞生长进入平台期，因此考虑后续实验需要，选用1×104cells·孔-1为实验条件。

图2 实时无标记细胞分析系统(RTCA)检测出不同密度HBE细胞培养的细胞指数(CI)曲线注：a. 细胞种植后黏附期；b. 快速分裂期；c. 平台期。Fig. 2 Real-time cell analysis system (RTCA) detected Cell Index (CI) of HBE cells at different densitiesNote: a. Cell adhesion period after planting; b. Rapid fission stage; c. Plateau stage.

2.2.2 RTCA法测SRM 1650b和SRM 2975致HBE细胞毒性实验结果由图3(a)和3(c)可知，将HBE细胞接种于E-Plate 16板后，在20 h时分别向每孔加入SRM 1650b和SRM 2975悬液，RTCA实时监测NCI的变化。由图3(b)可知，暴露6 h后，与对照组相比，染毒浓度为28 mg·L-1和56 mg·L-1的SRM 1650b组，测得的NCI值低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；暴露12、24和48 h后，与对照组相比，染毒浓度为14、28和56 mg·L-1的SRM 1650b组，测得的NCI值均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。由图3(d)可知，暴露6、12、24和48 h后，与对照组相比，染毒浓度为3.5、7、14、28和56 mg·L-1的SRM 2975组，测得的NCI值均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 RTCA检测SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE细胞的标准化细胞指数(NCI)值变化注：(a)和(c)是RTCA实时监测SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE细胞的NCI值，(b)和(d)为RTCA法检测SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE细胞6、12、24和48 h后NCI值变化；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照相比；attack表示DEP开始对HBE细胞进行暴露处理。Fig. 3 The normalized cell index (NCI) of HBE cells induced by SRM 1650b and SRM 2975 was monitored by RTCANote: (a) and (c) show that RTCA monitored NCI of SRM 1650b-exposed and SRM 2975-exposed HBE cells; (b) and (d) show that after SRM 1650b and SRM 2975 induced HBE cells, the changes of NCI were monitored by RTCA at 6, 12, 24 and 48 h; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control; attack means the HBE cells started to be exposed to DEP.

2.3 细胞凋亡实验测不同浓度不同时间段SRM 2975和SRM 1650b致HBE细胞毒性实验结果

将HBE细胞接种于六孔板后，在6 h时分别向每孔加入28 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975悬液，在12 h时分别向每孔加入14 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975悬液，在24 h和48 h时分别向每孔加入14 mg·L-1SRM 1650b和3.5 mg·L-1SRM 2975悬液。由图4(b)～(e)可见，在暴露的不同时间点，与对照组相比，SRM 1650b和SRM 2975组中测得的细胞凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 不同浓度不同时间段SRM 1650b和SRM 2975致HBE细胞凋亡率的变化注：(a)是不同浓度不同时间段SRM 2975和SRM 1650b致HBE细胞凋亡的流式细胞术检测散点图；(b),(c),(d),(e)暴露时间分别为6、12、24和48 h；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，与对照相比。Fig. 4 SRM 1650b and SRM 2975 resulted in the changes of apoptosis rate at different concentrations and exposure timesNote: (a) shows that the flow cytometry analyzed apoptosis rate of SRM 1650b-exposed and SRM 2975-exposed HBE cells at different concentrations and exposure times; for (b), (c), (d) and (e), the exposure times were 6,12, 24 and 48 h, respectively; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control.

3 讨论(Discussion)

本研究发现，SRM 1650b和SRM 2975均可致HBE细胞损伤，产生细胞毒性，并呈现出剂量-效应相关性，且随着DEP暴露时间的增加细胞活性率下降更为明显，且在同一染毒浓度、暴露时间，与SRM 1650b相比，SRM 2975致HBE细胞毒性更强。DEP作为一种空气污染颗粒物，其物理化学特性高度依赖于燃料和发动机，是柴油机主要的副产物之一[13-14]。本研究使用的2种暴露物质DEP SRM，是在受控条件下生产的，分别代表了重型发动机(SRM 1650b)和轻型发动机(SRM 2975)排放的颗粒物[11]，都可以诱发HBE细胞产生细胞损伤[15]。这2种颗粒物致HBE细胞毒性的差异可能与其理化性质有关。SRM 1650b在超纯水中平均粒径约为0.4259 μm，SRM 2975在超纯水中平均粒径约为0.2216 μm，提示DEP的粒径大小可能是影响毒性效应的因素之一[11]。小粒径DEP更容易穿透细胞膜进入细胞发挥毒性作用。

本研究发现，在RTCA实时监测中，低浓度的染毒组，比如暴露12 h后14 mg·L-1的SRM 1650b组已经表现出有统计学差异的细胞毒性，而相同时间条件下CCK-8法在28 mg·L-1才检测出显著的细胞活性下降，说明在细胞毒性检测水平上，RTCA法更加灵敏。且由细胞凋亡实验证实，RTCA法更能发现不同组之间的统计学意义差异。细胞毒性的检测是毒理学机制研究的基础，CCK-8法是检测细胞存活率的传统方法，被使用了很长时间，RTCA是检测细胞毒性的新技术，且本研究得出RTCA相比CCK-8法更适用于检测DEP致HBE毒性，RTCA灵敏度更高，实用性更高。但在其他研究方面，RTCA是否可以取代CCK-8法仍有疑问，因此本研究分析了2种方法的局限性。

CCK-8法是细胞毒性实验中的经典方法，该方法已被广泛用于一些细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验，具有技术成熟、经济实惠等优点[16-17]。本研究在用CCK-8法检测DEP致HBE细胞的毒性实验中，也发现其局限性。①由于CCK-8试剂中含有的WST-8在1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，化学过程受温度、时间等因素影响，造成系统误差，对实验结果造成影响。②操作步骤繁琐，从而对实验结果产生影响。③CCK-8法只能在已设计好的暴露时间点，检测DEP致HBE细胞毒性，不可反复多次测量，具有一次性。经本文验证，相较CCK-8法，RTCA法操作步骤简单，不需要多次吸出培养液加入DEP悬液进而影响细胞状态，保证实验细胞质量，组内差异小，其次RTCA是全自动、可实时连续动态监测，一次实验可以得出不同暴露时间的染毒结果。之前的研究同样表明，相对于传统方法，RTCA对细胞状态影响小，能够更好地继续进行其他的实验性研究[18]。

同时，本研究还发现RTCA法也存在一些局限性，包括：①悬浮细胞无法生长在细胞培养板底部，由于仪器设计原理，无法检测阻抗值的变化，只能检测暴露前被诱导为贴壁细胞的悬浮免疫细胞的NCI值，但这类悬浮细胞种类极少，因此在检测DEP致悬浮细胞活性时，更适合用CCK-8法；②RTCA不适用于气液暴露下DEP致任何细胞毒性的检测，RTCA无法和气液暴露装置联用，因此在本研究中，实验采用的是液液暴露的方式。由此可见，在检测DEP致悬浮细胞毒性的研究和气液暴露装置联用时，应继续采用传统的CCK-8法。有研究表明，在药物的细胞毒性评价方面需考虑这2种方法的适用性，CCK-8法不适合有色药物的细胞毒性评估，RTCA不适合含电活性成分的抗癌药物的细胞毒性评估[8]。

本实验旨在通过RTCA和CCK-8法检测2种DEP(SRM 1650b和SRM 2975)致HBE细胞毒性的研究，对2种方法进行比较。相对于CCK-8法，RTCA法更精准地检测DEP致HBE细胞毒性，与细胞凋亡实验的结果有高度的一致性，因而，可用作颗粒物染毒HBE细胞后检测细胞毒性的常规检测方法。但RTCA在其适用范围有更多的局限性，因此，RTCA如何检测悬浮细胞的活性率需继续研究。研究同时提示，轻型和重型发动机的DEP排放值得人们关注，本实验为进一步研究DEP对肺部损伤的毒性作用机制研究提供科学依据，但SRM 1650b和SRM 2975产生毒性作用的能力不同，可能与颗粒物的粒径、有机物的物质含量和理化特性等有关，在接下来的研究中有待证实。

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