羟丙基-β-环糊精对白屈菜红碱的包合工艺优化

梁浩 钱玺丞 杜晓静 郁建生

摘要：为研究羟丙基-β-环糊精对白屈菜红碱的包合作用，对影响白屈菜红堿包合率的羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱的包合比、包合温度、包合时间等3个因子进行研究。在单因素基础上，通过Box-Behnken响应面法的3因素3水平进行试验设计，以白屈菜红碱包合率为响应值，优化包合工艺。结果表明，影响包合率的因素表现为包合比>包合温度>包合时间，最终确定最佳试验条件：包合反应温度为61 ℃，包合反应比例为10 ∶1，包合反应时间为190 min，在此条件下包合率为72.75%，与软件预测值（72.88%）接近（相对误差0.178%）。

关键词：羟丙基-β-环糊精;白屈菜红碱;响应面分析法;包合作用;工艺优化

中图分类号： R284文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）12-0135-05

收稿日期：2020-09-01

基金项目：西部地区创新能力建设项目（编号：发改办高技[2016]2195号）;贵州省科技支撑计划（编号：黔科合支撑[2019]2363号）;铜仁市科技计划（编号：铜市科研[2019]113号、铜市科研[2019]109号）。

作者简介：梁 浩（1987—），男，河北保定人，博士，副教授，主要从事药用植物有效成分开发及应用研究。E-mail：249672111@qq.com。

白屈菜红碱（chelerythrine）是从博落回、白屈菜、血水草以及飞龙掌血等药用植物中提取得到的苯并菲啶型生物碱[1-3]。研究表明，白屈菜红碱具有抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗肝纤维化等多种药理作用[4-5]，对农作物病虫害的防治也有较好的效果[6]。因此，白屈菜红碱被广泛应用于生物医药、兽药和饲料添加剂以及生物农药中。尤其是在动物生产过程中，白屈菜红碱具有促进动物生长、改善动物健康、预防动物疾病等多种功能[7]，由于白屈菜红碱的分子结构特点，生物利用度较低，所以有必要通过制剂技术改进或提高白屈菜红碱的溶解度和生物利用度[8]。

在提高难溶性药物的水溶性和增加稳定性方面，环糊精包合技术显示出较大的优势[9]，而且药物经β-环糊精包合后可减轻口服后对胃肠道的刺激，提高疗效，降低药物毒性，并能保持药物原有的性质和作用[10]。在众多的β-环糊精衍生物中，羟丙基-β-环糊精（ HP-β-CD）显示出较强的应用价值，主要体现在水溶性更好，常温下它在水中的溶解程度超过50%;人体中耐受性好，在体内基本上不累积，也不被分解代谢;低毒、安全、无肾毒性、较好的药物增溶性等。目前由于其优良的性质，在医药和食品等多个领域有着广泛的应用[11]。

目前，关于环糊精及其衍生物对白屈菜红碱的包合研究较少，本研究采用饱和水溶液法，以羟丙基-β-环糊精为包合材料，对白屈菜红碱进行包合，并通过响应面法优化白屈菜红碱包合物的制备工艺，采用紫外光谱法对白屈菜红碱和羟丙基-β-环糊精包合物和两者的混合物以及羟丙基-β-环糊精的紫外光谱进行测定，并验证白屈菜红碱-羟丙基-β-环糊精包合物是否形成。本研究旨在将白屈菜红碱制备成 HP-β-CD包合物，以期改善其在水溶性和稳定性方面的缺陷，从而为拓宽其适用范围提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

白屈菜红碱原料（高效液相色谱检测纯度为94.3%），参照文献[12]自制;羟丙基-β-环糊精（纯度99%）、白屈菜红碱标准品（纯度≥98%），均购自上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、浓硫酸等试剂（分析纯），均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

超声波清洗机（KQ-218），购自昆山市超声仪器有限公司;紫外可见分光光度计（T10CS），购自北京普析通用仪器有限责任公司;超高效液相色谱仪（Agilent1290），购自安捷伦科技有限公司;十万分之一分析天平（CPA225D），购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;千分之一分析天平（AE223），购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司;真空干燥箱（DZF6030A），购自上海一恒科学仪器有限公司;数显恒温集热式磁力搅拌器（DF-101S），购自巩义市予华仪器有限责任公司;鼓风干燥箱（DHG-9013A），购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 白屈菜红碱羟丙基-β-环糊精包合物的制备 称取一定量HP-β-CD，加入5 mL蒸馏水，水浴加热搅拌至溶解，缓慢加入0.1 g白屈菜红碱，避光搅拌，搅拌结束后将反应液在40 ℃进行真空干燥，粉碎后即得包合物粉末。

1.3.2 白屈菜红碱标准曲线的绘制 准确称取标准品11.74 mg，用1.0%盐酸-甲醇溶液（体积比为50 ∶50）溶解于容量瓶（100 mL）中，并定容，配制得到白屈菜红碱标准溶液母液。准确量取标准品母液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于容量瓶（25 mL）中，并定容。液相色谱条件：选择检测波长271 nm，C18色谱柱，采用乙腈-0.1%磷酸作为流动相，控制流速为0.5 mL/min;保持柱温25 ℃，进样量为2 μL。

1.3.3 样品溶液的配制及含量测定 按单因素试验方案和响应面设计方案制备白屈菜红碱羟丙基-β-环糊精包合物，准确称取10 mg白屈菜红碱包合物，采用1.0%盐酸-甲醇溶液（体积比为50 ∶50）溶解，超声1 min，置于容量瓶（25 mL）中，稀释定容，摇匀，采用有机溶剂微孔滤膜（0.45 μm）过滤，得待测包合物样品溶液。采用高效液相色谱法（检测波长为271 nm）测定包合物中白屈菜红碱含量。

1.3.4 HP-β-CD-白屈菜红碱包合物制备单因素试验

对影响白屈菜红碱包合率的羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱的包合比、包合温度、包合时间等3个单因素进行试验，进而确定各因素响应面试验取值范围。包合率=1-（滤液中白屈菜红碱质量+包合物中未反应的白屈菜红碱质量）/称量白屈菜红碱质量×100%。

1.3.4.1 包合比对白屈菜红碱包合率的影响 在包合温度为60 ℃，包合时间为1 h的条件下，研究不同包合比（1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1）对白屈菜红碱包合率的影响，筛选最佳包合比。

1.3.4.2 包合温度对白屈菜红碱包合率的影响 在包合时间为1 h，包合比为6 ∶1的条件下，选取30、40、50、60、70、80 ℃ 6个包合温度，筛选不同温度下HP-β-CD 对白屈菜红碱的包合效果，得到最佳包合温度。

1.3.4.3 包合时间对白屈菜红碱包合率的影响 在包合比为6 ∶1，包合温度为60 ℃的条件下，筛选1、2、3、4、5、6 h反应时间下 HP-β-CD对白屈菜红碱的包合效果，筛选最佳包合时间。

1.3.5 响应面试验设计 结合单因素试验结果，选取对反应结果影响较大的3个因素，包合比（X1）、包合温度（X2）和包合时间（X3）进行试验，采用3因素3水平的响应面法（RSM） 设计，采用多元回归设计方法，以白屈菜红碱包合率（Y）为响应值，通过优化Box-Behnken响应面分析确定最佳的白屈菜红碱包合参数。

1.4 数据处理与分析

单因素试验均重复3次，取平均值，试验数据采用OriginPro 9.1 软件进行统计与分析，响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6.1软件统计与分析。

2 结果与分析

2.1 白屈菜红碱标准曲线及回归方程

以白屈菜红碱标准品含量（x）为横坐标，以峰面积（y）为竖坐标，所绘制的白屈菜红碱的标准曲线见图1，回归方程为y=0.741 59+17.113 87x，r2=0.999 95，在 0～46.96 mg/L范圍内有良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 HP-β-CD与白屈菜红碱的配比对包合率的影响

由图2可知，白屈菜红碱包合率随着包合比的增大而增大，当包合比达到10 ∶1时包合率达到44.1%，当包合比继续增大，白屈菜红碱包合率开始减小，因此选择10 ∶1为较佳条件。

2.2.2 包合温度对包合率的影响

由图3可知，白屈菜红碱包合率随包合温度的升高不断增大，当达到60 ℃时，白屈菜红碱包合率达到44.1%，之后随包合温度的升高，包合率开始下降，可能是60 ℃时包合过程已到达平衡，温度降低不利于白屈菜红碱进入羟丙基-β-环糊精当中，温度升高由于分子运动加剧，导致形成的包合物脱包合，因此选择 60 ℃ 为较佳包合温度。

2.2.3 包合时间对白屈菜红碱包合率的影响

由图4可知，白屈菜红碱包合率随着包合时间的延长而增大，搅拌3 h时包合率达到71.6%，之后随包合时间的延长包合率下降，可能由于包合时间较短时白屈菜红碱尚未完全进入羟丙基-β-环糊精当中，时间太长又会导致已形成的包合物脱包合。因此选择包合时间3 h为较佳条件。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 数学模型方程

选取对包合反应影响较大的3个因素[包合比（X1）、包合温度（X2）和包合时间（X3）]进行分析，包合试验设计因素及水平见表1。响应面试验结果见表2。将表2中的试验数据采用 Design-Expert 8.0.6.1软件进行分析，以白屈菜红碱包合率（Y）为固定量，以包合比（X1）、包合温度（X2）和包合时间（X3）为因变量，建立数学模型

方程为Y=71.46+8.14X1+1.95X2+0.31X3-2.66X1X2-0.17X1X3+0.39X2X3-12.76X21-4.35X22-0.45X23。对此模型方程进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，通过对模型方程显著性检验，该模型P<0.000 1，达到极显著水平（P<0.01），说明该模型高度显著，失拟项（P=0.412 0>0.05）不显著，

说明方程与试验拟合度较好，可用于羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱包合反应的分析与预测。模型方差分析结果表明，各影响因素对白屈菜红碱包合率影响大小的顺序为包合比>包合温度>包合时间。

2.3.2 包合工艺的响应面分析与优化

图5 为羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱包合工艺的响应面分析图。图5-a显示包合时间为3 h时，羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱的包合比与包合温度对包合率的影响，包合初始，包合率随包合温度的增大而增大，当包合温度达到一定值后，白屈菜红碱包合率又略有下降。

图5-b显示包合温度为60 ℃时，羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱的包合比与包合时间对包合率的影响，当包合时间较短时，白屈菜红碱包合率随包合比的增大而增大，但随包合时间的延长，包合率先增大后减少。

图5-c显示当羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱的包合比为10 ∶1时，包合反应温度和包合反应时间对包合率的影响，在不同包合反应温度下，包合率随包合时间的延长呈现先增大后减小的趋势，在不同包合时间下，白屈菜红碱包合率随包合温度的升高也呈现先增大后减小的趋势，在等高线图椭圆中心和响应面3D图的最高点处存在极大值。

2.3.3 HP-β-CD-白屈菜红碱包合物包合最优工艺条件确定

通过对响应面试验结果分析得到的理论最佳工艺条件：包合比为10.30 ∶1，包合温度为60.74 ℃，包合时间为3.17 h。在此条件下，羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱包合率理论最大值为72.88%。但考虑到实际操作性，将包合参数进一步修订，最终确定羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱的配比为10 ∶1，包合温度为61 ℃，包合时间为 190 min，将此条件重复3次取平均值，得到包合率为72.75%，与预测值相对误差为0.178%。证明拟合模型比较可靠，说明采用响应面分析的 Box-Behnken 组合设计优化得到的白屈菜红碱包合工艺参数准确可靠，具有一定的应用价值。

2.4 HP-β-CD-白屈菜红碱包合物形成的验证分析

通过对4种相同浓度的不同溶液（包括羟丙基-β-环糊精甲醇溶液、白屈菜红碱甲醇溶液、白屈菜红碱与羟丙基-β-环糊精混合物的甲醇溶液以及羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱包合物的甲醇溶液）进行紫外扫描后，其紫外光谱如图6所示。由于不同物质的紫外吸收光谱与物质的结构有特定的对应关系，因此不同物质的紫外吸收曲线波峰和波谷的位置均有差异。由图6可知，白屈菜红碱和白屈菜红碱-羟丙基-β-环糊精混合物（混合物）的波峰分別位于318、266.5 nm，羟丙基-β-环糊精-白屈菜红碱包合物（包合物）的紫外光谱吸收曲线波峰位于314、266 nm，因此可判定得到的物质并不是白屈菜红碱与羟丙基-β-环糊精两者的物理混合物，而是包合物。

3 结论

近年来环糊精包合技术的研究和应用越来越多，主要原因是其在提高药物的溶解性和稳定性以及降低药物毒性方面有很好的效果，从而拓宽药物的适用范围[13]，由于羟丙基-β-环糊精比母体 β-环糊精的水溶性更好、且毒性更低，所以选择羟丙基-β-环糊精对白屈菜红碱进行包合。

本试验研究了羟丙基-β-环糊精对白屈菜红碱的包合作用，在单因素试验基础上，利用 Box-Behnken 响应面法优化了白屈菜红碱的包合工艺，最后确定最佳工艺条件：包合比为10 ∶1，包合温度为61 ℃，包合时间为190 min，在此条件下白屈菜红碱包合率达到72.75%。通过对因素的交互作用进行分析，对白屈菜红碱包合率影响的大小顺序为包合比>包合温度>包合时间。经紫外光谱验证，包合物已经形成。本试验得到的羟丙基-β-环糊精与白屈菜红碱包合物的制备工艺稳定、可靠，为白屈菜红碱新制剂的研究开发以及拓宽白屈菜红碱的应用领域提供了理论依据。

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