番茄酸腐病病原菌分离鉴定和抑菌剂抑制效果

开 凯, 毕婉玲, 张 卫, 花晨艳, 张丹凤

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

樱桃番茄,又名袖珍番茄、迷你番茄,属茄科蕃茄属,一年生草本植物,其果实呈短椭圆形,果色桃红,品质较优,因外形小巧常被称为圣女果[1]。樱桃番茄果汁较多、酸甜可口,可作为水果或蔬菜,是一种深受消费者欢迎的农业经济作物。樱桃番茄富含维生素和矿物质,其中含有的番茄红素是人类摄取相关营养的主要来源[2],经常食用樱桃番茄能帮助人体预防癌症、增强机体免疫力。

酸腐病是番茄常见的病害之一,发病的番茄果实腐败酸臭,失去食用价值,也给番茄相关产业造成巨大的经济损失。文献[3]首次报道番茄酸腐病这一植物病害。因此,找到导致番茄酸腐病的病原菌并对其生物特性进行研究,并且找到合适的抑菌剂对其进行防治,具有重要的科研、经济价值和社会意义。

姜黄素是一种提取自姜黄根茎的多酚类化合物,黄色粉末,不易溶于水,易溶于甲醇和二甲基亚砜(DMSO)[4]。据报道,姜黄素具有明显的抑菌、抗病毒和抗氧化活性,目前已有证据表明姜黄素能够通过诱导活性氧的积累加速真菌细胞凋亡从而达到良好的抑制真菌的效果[5-7],因此在食品和医药领域得到越来越多的重视。

绿原酸是一种植物体在生长发育中有氧呼吸中生成的苯丙素类化合物,在苹果等多种植物中均可提取到,是金银花的主要抗菌成分[8]。研究表明:绿原酸能够在不影响食品品质的基础上对常见的食品腐败微生物进行抑制;绿原酸还具有抗氧化、消炎、防辐射、调节免疫等多种功效[9],逐渐成为食品安全和医疗保健领域新的关注热点。

1 材料与方法

1.1 实验材料及病原菌分离

樱桃番茄、已发病樱桃番茄均来自合肥工业大学翡翠湖校区农业园。根据文献[10]所述方法,将已发病番茄置于超净工作台,用已灭菌镊子小心撕去病斑部位与健康部位交界处果皮,夹取含有染病部位与健康部位交界处果肉(大小约0.5 mm×0.5 mm)于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基中,将培养皿用封口膜包好后置于25 ℃培养箱中培养,待7 d后菌丝基本长满培养基时用已灭菌打孔器在培养基上打孔取样,夹取菌饼倒置于新的PDA培养基中继续培养,重复纯化3代后得到纯净的病原菌。

1.2 培养基

根据文献[11-14]的方法,选择部分常用培养真菌培养基进行实验,具体配方如下:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(土豆200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL);马铃薯胡萝卜(potato carrot agar,PCA)培养基(马铃薯20 g,胡萝卜20 g,琼脂20 g,水1 000 mL);胡萝卜葡萄糖琼脂(carrot dextrose agar,CDA)培养基(胡萝卜100 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL);燕麦片琼脂(oat meal agar,OMA)培养基(燕麦30 g,琼脂20 g,水1 000 mL);玉米粉琼脂(corn meal agar,CMA)培养基(玉米粉30 g,琼脂20 g,水1 000 mL);高盐察氏(Czapek-Dox agar,CDA)培养基(NaNO32 g,KH2PO41 g,MgSO40.5 g,KCl 0.5 g,FeSO40.01 g,NaCl 60 g,蔗糖30 g,琼脂20 g,水1 000 mL);马铃薯蔗糖(potato sucrose agar,PSA)培养基(马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL)。所有培养基115 ℃高温高压灭菌30 min,分装至培养皿待用。

1.3 实验方法

1.3.1 病原菌回接验证

根据文献[15]的方法并适当修改,选取表面光洁、无病斑的樱桃番茄果实,使用1%次氯酸钠浸泡2 min,并用无菌水洗净,随后在超净工作台中自然风干,使用镊子在果实赤道部位制造3 mm直径的伤口,将10 μL孢子液(每mL液体中的孢子数为5×105个)注入伤口,待自然风干后将其置于25 ℃环境下贮藏并观察发病情况。实验重复5次,使用接种相同体积无菌水的番茄作为对照。

1.3.2 形态学鉴定

将病原菌培养10 d后观察菌落形态和产色素的情况。从菌落上挑取少量菌丝于载玻片,滴加少量清水,使用可视显微镜(上海上光)观察菌丝形态。挑选适量产孢菌丝于10 mL无菌水中,充分震荡5 min后过滤得到孢子悬浮液,吸取孢子悬浮液于载玻片上使用显微镜观察孢子形态。

1.3.3 分子生物学鉴定

称取约0.5 g病原菌菌丝于研钵,加入适量液氮,快速研磨至粉末并移至1.5 mL离心管,使用CTAB法[16]提取病原菌DNA。使用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)作为配对引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)片段扩增,根据全式金公司(中国,北京)Pfu酶产品说明书,20 μL PCR体系为:DNA模板1 μL,ITS1 1 μL,ITS4 1 μL,Pfu酶 0.8 μL,5×缓冲液4 μL,dNTPs 2 μL,ddH2O 10.2 μL; PCR程序为:预变性阶段95 ℃ 20 s,退火阶段55 ℃ 20 s,延伸阶段72 ℃ 30 s,共30个循环。

将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将测序结果在NCBI网站进行BLAST对比,使用MEGA 7.0软件利用极大似然估计法自举1 000次绘制进化树[17]并进行分析,通过序列相似性分析确定病原菌种类。

1.3.4 生长特性研究

参考文献[18]的方法,使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 分别调节PDA培养基pH值为5、6、7、8。选取7 d菌龄的菌饼,使用打孔器打孔后将菌饼倒置于培养基上,置于25 ℃培养箱培养,分别测量第3、5、7天菌落直径探究培养基pH值对其生长的影响。每个处理重复5次。

选取7 d菌龄的菌饼,使用打孔器打孔后将菌饼倒置于培养基上,分别置于22、25、28、31 ℃培养箱培养,分别测量第3、5天菌落直径探究温度对其生长的影响。每个处理重复5次。

依照1.2节所述配方,制备不同培养基。选取7 d菌龄的菌饼,使用打孔器打孔后将菌饼倒置于培养基上,置于25 ℃培养箱培养,分别测量第3、5、7 天菌落直径探究不同培养基对其生长的影响。每个处理重复5次。

1.3.5 抑菌剂对病原菌抑制效果

参考文献[19]方法,姜黄素(98%, Sigma)以50 g/L的质量浓度溶解在DMSO中,并使用已灭菌0.22 μm有机系式滤器过滤除菌,将母液于-20 ℃保存。使用时取适量于PDA培养基中使其终质量浓度分别为200、400、600 mg/L,以无姜黄素的PDA培养基为对照,测量第3、5、7天菌落直径。每个处理重复5次。

绿原酸(Fluorochem Ltd.)以300 g/L的质量浓度溶解在DMSO中,并使用已灭菌0.22 μm有机系式滤器过滤除菌,将母液于-20 ℃保存。使用时取适量于PDA培养基中使其终质量浓度分别为1、2、3 g/L,以无绿原酸的PDA培养基为对照,测量第1、2、3天菌落直径。每个处理重复5次。

1.4 数据分析

试验数据使用Excel 2013 进行统计、计算、制图,并用SPSS 17.0 进行方差分析,计算平均值之间是否存在显著性差异用Duncan多重检验法,P<0.05则认为差异显著。文中柱状图上所标注不同字母表示不同处理之间具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 病原菌的回接

自然发病樱桃番茄及回接发病状态如图1所示。从图1可看出，将分离出的病原菌回接到健康的樱桃番茄果实上,3～4 d可以引起果实腐烂发病,发病初期果实病变部位出现肉眼可见水渍状病斑,果皮软化并向内凹陷(图1b),随后发病果实病变部位出现白色圆形霉菌层并逐渐向外扩展,发病5～7 d时可闻酸臭味,果实病变部位向外流出酸臭液体,这些性状表现与病果(图1a)相一致。

图1 自然发病樱桃番茄及回接发病状态

2.2 病原菌的形态学鉴定结果

在培养基上培养10 d后进行观察,其形态如图2所示。图2a中,菌落呈圆形,菌丝为白色绒毛状或粉状,菌落较为平坦,菌落厚度适中偏薄,部分培养基上中心略微突起;图2b中,培养基背面呈弱暗红色,说明该菌株易于产红色色素;图2c为显微镜下照片,该菌菌丝无色透明,易分叉分支,部分菌丝有隔膜,可观察到该菌易于通过裂殖的方式产生大量节孢子;图2d为孢子形态,孢子无色透明,外形为椭圆形或长筒形,部分孢子末端稍平或圆钝,孢子大小为(2～5) μm×(5～15) μm。

图2 病原菌生物形态学分析

通过查阅《真菌鉴定手册》[20],鉴定该菌株符合地霉属真菌的基本形态特征。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定结果

病原菌ITS序列大小及进化树如图3所示。

图3 病原菌ITS序列大小及进化树

图3a为长度约350 bp的PCR产物。将测序结果在NCBI上进行比对,显示其与白地霉(Geotrichum)有99%的序列相似性,通过分析使用MEGA 7.0得到的进化树(图3b)可知,该菌株与白地霉Geotrichumcandidum有99%的亲缘相似率,且同该属内其他种差异较大。结合形态学分析结果可以鉴定该菌株为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、地霉属真菌白地霉。

根据科赫法则,可以认定分离得到的病原菌白地霉就是番茄酸腐病的病原菌。

2.4 病原菌的生长特性分析

2.4.1 pH值对白地霉的影响

pH值对白地霉的影响如图4所示。

图4 pH值对白地霉菌落直径和形态的影响

由图4a～图4d可知，同时接种第7天时的菌落形态也有一定差异,在pH值为6和7时菌丝生长更为致密,呈现更好的生长表现。从图4e可以看出,在菌落生长初期,不同pH值对白地霉菌落直径有一定影响,但随后逐渐趋同,第7天时不同pH值对白地霉菌落直径并无明显影响,这可能是由于该菌通过调节相关生理活动适应了不同的pH值环境。总体来看,该菌在中性和偏酸性环境中生长情况稍好于偏碱性环境,且pH值为7时白地霉最适生长,而市售绝大多数水果呈天然弱酸性,这也印证了这些具有适合该病菌生长的自然条件的水果易受到该菌的侵染。

2.4.2 温度对白地霉的影响

温度对白地霉菌落直径和形态的影响如图5所示。从图5可以看出，第5天的菌落形态(图5a～图5d)也没有特别显著的差异,仅31 ℃下的菌丝生长稍薄，温度为22～31 ℃时,不同温度下该菌的菌落直径差异不大(图5e)。这说明该菌对温度的适应能力较强,且其所适宜的环境温度范围也符合番茄酸腐病多发时的环境温度条件。结合菌落直径认为28 ℃是该菌的最适生长温度。

图5 温度对白地霉菌落直径和形态的影响

2.4.3 培养基对白地霉的影响

不同培养基对白地霉菌落直径和形态的影响如图6所示。从图6可以看出,不同培养基中白地霉无论是菌落直径还是菌落形态都有明显差异,且PDA培养基为最适宜白地霉生长的培养基。不同培养基能够为微生物提供不同比例的碳氮源和营养物质,因此不同培养基上白地霉生长情况有较大差异，说明该菌对不同碳氮源的利用能力有较大差异,结合不同培养基的配方组成,可以认为白地霉对有机碳氮源利用效果要优于无机碳源,并且葡萄糖、蔗糖等基本能源物质对于白地霉气生菌丝的生长和形成具有重要作用。番茄营养物质种类较多、含量较高,且有机碳氮源和葡萄糖等能源物质较为充分,具有适合白地霉生长的天然营养环境,这也为白地霉营腐生生长提供了必要的物质基础。

图6 不同培养基对白地霉菌落直径和形态的影响

2.5 抑菌剂对病原菌抑制效果

绿原酸、姜黄素对白地霉的抑制作用如图7、图8所示。菌落形态方面,第3天时使用绿原酸处理的白地霉菌落形态无明显差异(图7a～图7d);第7天时使用姜黄素处理的白地霉菌落形态有一定差异,随着姜黄素浓度的增加,白地霉的菌丝更为密集(图8a～图8d)。此外,使用绿原酸处理第2天后白地霉菌落直径已具有明显的梯度差异,而使用姜黄素处理后直至第5天时白地霉菌落直径才呈现较为明显的梯度差异。结合菌落直径和菌落形态来说,绿原酸对于白地霉的抑菌效果要稍好于姜黄素。从图7e、图8e可以看出,姜黄素和绿原酸2种抑菌剂对白地霉均具有一定的抑菌效果,且均表现出明显的剂量依赖的特点,即随着抑菌剂质量浓度的升高,对病原菌的抑制作用也随之增强,这与绿原酸、姜黄素2种天然提取物对于大多数真菌具有抑制效果的报道相一致。

图7 绿原酸对白地霉的抑制作用

图8 姜黄素对白地霉的抑制作用

3 结 论

本实验采用组织分离法,从自然发病的樱桃番茄上分理出酸腐病原菌并进行回接验证,通过形态学分析、分子生物学鉴定确定该病原菌为白地霉Geotrichumcandidum,这与文献[21]所报道的番茄酸腐病病原菌酸腐节卵孢Oosporalacti不同,说明导致番茄酸腐病的病原菌有多种,具有一定的地区差异。

本研究发现白地霉作为植物病原微生物,其最适生长pH值为7、最适温度为28 ℃,但该菌也具有一定的环境适应性,对pH值和温度的敏感性较低,能够在一定的pH值和温度范围内正常生长,这与文献[22]的结果相一致;该致病菌在不同培养基上生长差异较大,PDA为其最佳培养基,且总体来说白地霉对成分更为复杂的有机碳氮源的利用效果更好,生长更为快速,与文献[17]的研究结果相一致。白地霉的生物学基本特性说明其作为一种喜好有机质生长环境和具有一定环境适应性的病原菌,对于水果采后保鲜具有较大的潜在危害,因此有必要寻找可行的方式对该病菌进行防治。

本研究初步证明姜黄素、绿原酸作为植物天然提取抗菌类物质对该病原菌具有抑菌作用,且绿原酸抑菌作用更加明显,下一步可以对相关抑菌剂的抑菌机理等进行研究,以期为番茄酸腐病的防治提供新的思路。