包包曲中可培养酵母菌的分离纯化与鉴定

向丽萍，范斌强，黄 娇，杨志龙，伍 强，余有贵

（1.邵阳学院食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000；2.生态酿酒技术与应用湖南省重点实验室，湖南邵阳 422000；3.湖南湘窖酒业有限公司，湖南邵阳 422000）

随着科学的进步，酿酒技术也越来越先进，应用高品质强化酒曲和改进酿酒工艺，在保证酒的品质的条件下，尽可能降低成本，提高原料淀粉利用率，增加出酒率[1-3]。国内学者也对不同样品中的酵母菌进行分类，采用菌落观察、形态学观察、Biolog微生物鉴定系统、API 50 CHL 和API 20 C AUX 生化试剂盒鉴定、16S rDNA 和26S rDNA 序列的分子生物学鉴定、26S rDNA D1/D2基因扩增和测序分析等方法，成功鉴定到所测样品中不同的酵母菌[4-8]。崔梦君[9]从米酒曲中分离酵母菌，经鉴定为扣囊复膜酵母和酿酒酵母，用于红枣酒的制备。马佳佳[10]从凤窝酒曲中分离到的45 株酵母菌，被鉴定为8 个种。武伟伟[11]对不同发酵时期的树莓酒进行酵母菌的分离纯化，选择代表菌株进行26S rDNA D1/D2区序列分析，共分离出323 株酵母菌，形态学初步鉴定为12类。霍颖玙[12]以毕赤酵母、地衣芽孢杆菌作为主要菌种制备强化大曲并进行发酵实验，结果表明，毕赤酵母不会影响地衣芽孢杆菌的生长及代谢。杜刚[13]对6种市售酒曲样品中分离出的酵母菌进行26S rDNA 序列分析，将鉴定出的酵母菌进行猕猴桃汁发酵，研究发现其发酵液含25 种挥发性成分。王珍[14]以凤型大曲为菌种来源，分离筛选耐高温高产酒精酵母，比较分析混合菌种模拟固态发酵，用于大曲实际生产制备，提升了出房曲糖化力、液化力、发酵力、酯化力。周森[15]以菌剂模式添加两种生香酵母到二锅头酿造过程中，发酵前期酒醅中生香酵母较活跃，提高了实验基酒中总酸、总酯和乙酸乙酯含量。刘延波[16]从中高温大曲中筛得一株酵母菌，耐45 ℃高温，通过26S rDNA 序列分析确定菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，其最适生长温度为37 ℃，12 %乙醇耐受性，产酒精能力较强。从酒曲中通过筛选比较各种酵母菌的发酵力，选择高发酵力的酵母菌，再利用纯酵母菌制备强化酒曲，改善大曲的催化效率，提高出酒率，对酿酒企业创收具有重要意义。本研究以湘窖大曲为研究对象，通过平板划线的方式分离纯化出酵母菌，再通过YPD 培养基、WL 培养基、生物显微镜、VITEK MS鉴定等方式对酵母菌进行分类鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 曲样、试剂

湘窖大曲：取自湖南省湘窖酒业有限公司制曲车间成品大曲。

试剂及耗材：蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、琼脂等培养基配制试剂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯霉素（≥720 u/mg），购自海三杰生物技术有限公司；美兰染液，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；香柏油，购自上海生物制片厂。

1.1.2 培养基

YPD 培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂7.5 g，水500 mL，121 ℃灭菌20 min。

WL 培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5 %，葡萄糖5%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.055%，氯化钾0.0425%，氯化钙0.0125%，氯化铁0.00025%，硫酸镁0.0125%，硫酸锰0.00025%，溴甲酚绿0.0022%，水100 mL，调pH值到6.5，121 ℃灭菌20 min。

SDA培养基：葡萄糖2 g，蛋白胨5 g，琼脂7.5 g，水500 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器设备

G154-DWS 型高压蒸汽灭菌锅，购自致微（厦门）仪器有限公司；BM1000 型显微镜，购自南京江南永新光学有限公司；101-2AB 型电热鼓风干燥箱，购自天津泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-1FD 型单人单面垂直净化工作台，购自苏州博莱尔净化设备有限公司；H21-6 型电热恒温水浴锅，购自北京市东霞电子仪表厂；FW-400A 型万能粉碎机，购自北京中兴伟业仪器有限公司；SCIENTZ-18N 型恒温培养箱，购自北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 湘窖大曲酵母菌的初步分离

取4 个月的成品曲，将包包曲粉碎后装于试剂瓶中并贴上标签。准确称取25.0 g 样品于装有225 mL 无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，同时制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释样品液。

取100 μL 制备好的稀释度为10-1的样品稀释液接种至YPD 培养基上，涂布均匀，贴好标签。重复此操作，分别将稀释度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的样品稀释液接种到平板上，涂布均匀，同一梯度做3个平行，贴好标签。同时取100 μL无菌水接种至平板上，涂布均匀作为空白对照。将接种后的平板于28 ℃培养箱倒置培养2 d。

（2）坡口开制 600MPa和800MPa级别优先采用坡口机、铣边机加工，当采用热切割方法须将割口表面淬硬层、过热组织等用砂轮磨掉，磨削层厚≥1mm。

1.2.2 酵母菌的分离纯化

观察平板菌落生长情况，挑取20 株典型单一菌落，分别命名为H1-20，将它们划线于YPD 固体培养基，按H1至H20依次贴好标签，于28 ℃培养箱倒置培养2～5 d。将纯种酵母菌接种至YPD 固体斜面培养基上，贴好标签，于28 ℃条件下培养2 d，待菌落生成后，保藏备用。

1.2.3 酵母菌的分类鉴定

（1）YPD培养基中菌落形态观察。从斜面中挑取菌种并接种在新的YPD 培养基上，按照对应斜面的编号依次为平板编号并贴好标签，28 ℃倒置培养2 d。观察菌落形态并拍照记录。

（2）WL 培养基中菌落形态观察。从斜面中挑取菌种并接种在WL 培养基上，按照对应斜面的编号依次为平板编号并贴好标签，28 ℃倒置培养2～5 d。观察菌落形态并拍照记录。

（3）显微镜下细胞形态观察。点燃酒精灯，在载玻片中心滴一滴无菌水，然后用接种环挑取少量菌体在无菌水中涂布均匀，固定菌体，用美兰染色几分钟，然后用无菌水冲洗干净，干燥后盖上干净的盖玻片。在显微镜下从低倍镜到高倍镜依次观察并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 大曲中酵母菌的分离与纯化

分别取100 μL 10-1～10-6这6 个梯度的大曲稀释液接种在YPD 培养基上，其生长情况如图1 所示。10-1～10-6这6 个梯度中，只有前4 个平板有微生物生长，其中包括霉菌、细菌和酵母菌。根据酵母菌形态描述，挑选20 株典型的单一酵母菌菌落进行分离纯化。

图1 各梯度样品稀释液中的酵母菌在YPD培养基上的生长情况

对上面挑选出来的20 株酵母菌进行进一步的分离纯化，经3 次平板划线，分离纯化获得的酵母菌菌落形态如图2所示。

图2 酵母菌的分离纯化

由图2 可知，经过3 次分离纯化后的酵母菌已无其他杂菌污染。将此次纯化得到的酵母菌接种于YPD斜面固体培养基上保藏以供之后鉴定用。

2.2 酵母菌的分类鉴定

2.2.1 酵母菌在YPD培养基上的菌落形态观察

观察H1—H20这20株酵母菌在YPD培养基上的菌落形态，可以将这些菌株大致分为3 类，分别命名为JM1、JM2、JM3，在YPD 培养基上的生长状况如图3所示。

图3 3种类型酵母菌在YPD培养基上的生长情况

由图3 可知，3 类酵母在YPD 培养基上的生长状况主要可以从颜色和菌落形态区分开来。从颜色上看大多数菌株表现为乳白色，表面附有一层透明状物质，还有的表现为白色，极少数为雪白色；从形态上来看大多数为球形凸起，表面光滑湿润，有的菌落为球形凸起但菌落较小为点状，有的菌落平坦、黏稠菌落较大。20 株菌落在YPD 培养基上的具体生长情况见表1。

表1 20株酵母菌在YPD培养基上的生长情况记录

2.2.2 酵母菌在WL培养基上的菌落形态观察

观察H1—H20 这20 株酵母菌在WL 培养基上的菌落形态，也可以将这些菌株大致分为3 类，而且其编号可与上述利用YPD 培养基分出的3 类相对应。在WL培养基上的生长状况如图4所示。

图4 3种类型酵母菌在WL培养基上的生长情况

由图4 可知，酒曲中酵母菌菌落在WL 培养基中颜色变化稍有显现，大部分菌株在WL 培养基上表现出与其在YPD 培养基上不一样的颜色。有的表现出草绿色，表面附有一层白色，有的表现出深绿色，有的表现出白色，其在WL 培养基上的具体生长情况记录见表2。

表2 20株酵母菌在WL培养基上的生长情况记录

2.2.3 大曲酵母菌的细胞形态观察

分别在以上3 种类型中挑选1 株在显微镜下做镜检(油镜10×100)，在100 倍油镜下观察到的结果如图5所示。

图5 生物显微镜镜检结果

2.2.4 VITEK质谱鉴定

从以上3种类型的酵母菌中分别选1株在SDA培养基上培养，酵母菌在SDA 培养基上的生长状况如图6所示。

图6 3种类型酵母菌在SDA培养基上的生长情况

由图6 可知，3 种类型的酵母菌在SDA 培养基上的菌落颜色均为白色，JM1 类型的菌落形态光滑，边缘平整，菌落较大。JM2 类型的菌落形态为圆形凸起，JM3 类型的菌落形态较平坦，边缘不规则。这三类的VITEK 质谱仪的检测结果分别如图7所示。

图7 VITEK质谱仪检测图谱

通过对比菌种库的蛋白质量指纹图，得出JM1类型的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，JM2 型的酵母为菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa)，JM3 型的酵母为粉状米勒酵母(Millerozyma farinose)。

3 结论

结合菌株在YPD 培养基和WL 培养基上的形态特征、镜检结果以及VITEK MS 检测结果，可以对湘窖酒业大曲中的酵母菌做出初步分类并分为三大类。JM1 类是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌落呈乳白色，表面附着一层透明状物质，表面湿润光滑，圆形凸起，边缘规则，属于这一类的有10 株，分别为H2、H4、H5、H10、H11、H12、H13、H15、H16、H17；JM2 类是菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa)，菌落呈白色，球形凸起，菌落较小，边缘规则，属于这一类的有5 株，分别为H1、H3、H6、H7、H8；JM3 类是粉状米勒酵母(Millerozyma farinose)，菌落呈雪白色，菌落大而平坦，表面黏稠，边缘不规则，属于这一类的有5 株，分别为H9、H14、H18、H19、H20。从湘窖酒业成品曲中分离纯化出的酵母菌，为强化酒曲的研发提供菌种资源。