五株酵母菌的分离鉴定及产丁二酸能力分析

张 霞，雷学俊，杨康卓，罗青春，廖勤俭，刘多涛，乔宗伟，2，郑 佳，2

（1.宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644007）

酵母菌是白酒酿造微生物区系中非常重要的组成部分，它可以分解酿造原料产生酯类、醇类、酮类、酸类、酚类、烯类、吡嗪类等风味物质[1]，对产酒率和酒质至关重要。

酵母菌发酵代谢可产生一种叫丁二酸的物质，又叫琥珀酸，是一种二元羧酸，能发生二元酸的大多数典型反应，如卤化、酯化、碘化等，也是合成各种复杂有机物的中间体。丁二酸作为三羧酸循环过程中的一种四碳化合物被广泛应用于医药、食品、化工、农业等行业[2-3]，可用于合成氨基酸、镇静剂、维生素、1,4-丁二醇、N-甲基吡咯烷酮以及酸化剂、风味调节剂等[4-6]，琥珀酸（包括盐类）可产生酸味和呈味物质，可用于豆酱、酱油、日本酒、调味料[6]等。丁二酸进行酯化形成的丁二酸酯类是一种生物活性成分，可以提高白酒的健康价值，而且丁二酸酯类具有愉快的气味，对酒类的香味呈现有着一定的贡献[7-10]。丁二酸还可以作为中间体合成γ-丁内酯、1,4-丁二胺、四氢呋喃等化合物[11]，这些化合物对白酒的风味形成有重要作用。

卢春芳等[12]在6株酵母菌中筛选出高活性酵母菌，其中热带假丝酵母产丁二酸的能力最强，培养液中丁二酸含量为119.70 μg/mL；高翠娟等[13]通过基因敲除的方法获得可积累琥珀酸的解脂酵母重组菌，以提高琥珀酸的产量；申乃坤等[14]以牛胃内容物为菌源,利用富马酸钠为唯一碳源并加入高浓度丁二酸钠的选择培养基筛选到1 株丁二酸产量较高，副产物较少的菌株，经鉴定为产琥珀酸放线杆菌。

本研究从不同培养基之间产丁二酸能力高低出发，通过5 株不同属的酵母菌在不同培养基之间发酵产丁二酸的对比，发现这5 株不同属的酵母菌在五粮粉液中产丁二酸能力最强，而五粮粉则是五粮液酿造的粮食原材料，这对研究五粮液白酒风味多样性的形成有一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

所有酵母菌株均由本实验室保藏，分离自五粮液酿造环境中。

1.1.2 培养基

分离筛选培养基：麦芽汁琼脂培养基、YEPD琼脂培养基均为商业用合成培养基。

发酵培养基：麦芽汁培养基、YPD 液体培养基均为商业用合成培养基。

五粮粉[15]糖化液：五粮粉糖化液由高粱、小麦、大米、糯米和玉米5 种粮食按一定比例打碎混合组成，五粮粉∶水以1∶10 比例煮沸糊化，冷却后加入糖化酶、液化酶，最后过滤调糖度终浓度至12～13°Bx。

以上培养基均121 ℃下0.1 MPa灭菌20 min。

1.2 主要试剂和仪器

麦芽汁琼脂培养基、YEPD 琼脂培养基、麦芽汁培养基、YPD 液体培养基，青岛海博生物技术有限公司；葡萄糖(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；API20ACUX 鉴定试剂盒，生物梅里埃公司；FKC-1型浮游菌采样器，浙江苏净净化设备有限公司；离心机，Eppendorf 公司；显微镜，Olympus 公司；生化培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；美国Agilent 公司1290 系列高效液相色谱仪(HPLC)-6520B 系列质谱检测器（QTOF），Agilent MassHunter 数据采集工作软件、定性定量分析软件，Milli-Q 超纯水机（美国Millipore公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的分离

在五粮液酿酒车间和制曲车间外围环境采集样品，采用FKC-1 型浮游菌采样器，距离地面80 cm，将直径为9 cm 的麦芽汁琼脂平板置于采样器内，每次采样设置3 个平行，空气流量为100 L/min，采样时间为1 min。然后将平板倒置于28 ℃培养箱中培养2～3 d，待菌落长出后，挑选菌落形态不同的疑似酵母单菌落于麦芽汁琼脂培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3 次，直至平板上的菌落都为同一形态，利用传代培养法，在4 ℃下进行斜面保存并编号。

1.3.2 菌株的鉴定

1.3.2.1 菌株形态学鉴定

参照《酵母菌的特征与鉴定手册》进行[16]。

菌落形态观察：将纯化后的菌株接种于YEPD平板，置28 ℃下培养2～3 d，单菌落观察，并记录菌落的大小、颜色、形状、质地、透明度、边缘、湿润程度等菌落特征。

显微镜观察细胞形态：挑取单菌落于5 mL YPD 液体培养基中28 ℃、120 r/min 振荡培养24 h，显微镜下观察细胞的形态特征。

1.3.2.2 菌株生理生化鉴定

按照API 20A CUX 鉴定试剂盒所述方法测定菌株的生理生化特征。假菌丝观察：将酵母接种于玉米粉琼脂培养基上，28 ℃培养3 d，观察酵母是否含有假菌丝。

1.3.2.3 菌株分子鉴定

基因组DNA的提取：将活化的菌株接入40 mL麦芽汁培养基中，160 r/min、28 ℃培养24 h 后，室温、12000 r/min 离心5 min 获得菌体，用Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒提取菌株的基因组DNA，置于-20 ℃下备用。

PCR 扩增：采用酵母菌通用引物为NL1（5-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'），PCR 反 应体系包括0.5 μL 的基因组DNA、2.5 μL 的10×Buffer（含Mg2+）、1 μL的dNTP、0.2 μL的聚合酶、0.5 μL的引物、0.5 μL 模板，加双蒸水至25 mL；PCR 循环条件为94 ℃4 min 预变性、94 ℃45 s 变性、55 ℃45 s退火、72 ℃1 min延伸、循环30次，72 ℃10 min修复延伸，4 ℃终止反应。经PCR 反应扩增出26S rDNA 产物，用PCR 及酶反应产物纯化试剂盒将PCR 产物进行纯化，将纯化产物交由上海生工生物工程股份有限公司完成测序工作。

1.3.3 酵母菌的系统发育分析

参考文献[17]，将测得的26S rDNA D1/D2 序列在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，选取相似度较高的模式菌株的26S rDNA D1/D2 区域序列作为参比对象；利用MEGA5.0 软件进行多序列比对、Kimura-2 模型计算进化距离、最后采用邻位相连(Neighbor-Joining)绘制系统发育树，其中进化树拓扑分析为1000次重复取样的结果。

1.3.4 丁二酸的测定

取终浓度酵母菌活菌数105～106个/mL菌液接种于3 种发酵培养基中，以未接菌的培养基作为对照。28 ℃静置培养48 h 后，将发酵液12000 r/min离心5 min，取上清液0.22 μm 滤膜过滤，用HPLC法测定发酵液中丁二酸的含量。色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1*100 mm 1.8-micron)；柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL；流动相为甲醇B（液质级）和超纯水A（含0.05 g/L甲酸）；梯度洗脱条件：0～8 min：2 %～98 %B，8.1～12 min：98 %B，12.1～14 min：2 %B，15 min：stop。质谱条件：采用电喷雾电离源(DESI)；负离子模式扫描；离子源温度为325 ℃；干燥气流量为10 L/min；雾化器压力为40 psig；碰撞电压为90 V。标曲：Y=202.7x+10770。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 形态特征

5株不同属酵母菌菌落和显微镜形态结构如图1，具体形态结构描述见表1。

表1 酵母菌的菌落和微观形态描述

图1 酵母菌的菌落和微观结构

2.1.2 生理生化特征

生理生化特征鉴定结果如表2 所示，此5 株菌均能发酵利用葡萄糖作为碳源，均不能发酵利用2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、侧金盏花醇、木糖醇和N-乙酰氨基葡萄糖。Y3可利用D-木糖，其他4 株菌则不可以；Y1、Y2、Y3、Y5 可发酵利用的碳源种类较多，而Y4 仅可利用D-半乳糖和纤维二糖两种碳源。形态学试验结果显示，除了Y5 有假菌丝外，其他4株菌均没有假菌丝出现。

表2 酵母菌生理生化检测结果

2.1.3 菌株的分子鉴定结果

从表3 可以看出，Y1 与Kazachstania bulderi的相似度为100 %、Y2 与Saccharomyces cerevisiae的相似度为100 %、Y3 与Zygosaccharomyces bailii的相似度为100 %、Y4 与Naumovozyma castellii的相似度为99.52 %、Y5 与Saccharomycopsis fibuligera的相似度为100%，说明菌株Y1、Y2、Y3、Y4 和Y5都已经在NCBI中找到相似度非常高的菌株。

表3 酵母菌26S rDNA的同源性分析结果

2.2 系统发育分析

此5 株不同属的酵母菌株的26S rDNA D1/D2序列和用BLAST 检索到的与之有高度同源性菌株的26S rDNA D1/D2 序列通过MEGA5.0 软件进行比对和构建N-J 系统发育树，结果见图2。可通过系统发育树的建立对此5 株不同属的酵母菌种间亲缘关系进行直观界定。

由图2 可以直观地看出，Y1 和Kazachstania bulderi聚为一支、Y2 和Saccharomyces cerevisiae聚为一支、Y3 和Zygosaccharomyces bailii聚为一支、Y4和Naumovozyma castellii聚为一支、Y5 和Saccharomycopsis fibuligera聚为一支。结合相似度（表3）和系统发育树（图2），该5 株酵母菌可以清晰地鉴定到种。

图2 基于26S rDNA D1/D2区域序列和neighbor-joining分析法绘制菌株系统发育树

2.3 不同培养基条件下丁二酸产量的测定

用HPLC 法测定发酵液中丁二酸的含量，结果如图3 所示。同一菌株在3 种培养基中丁二酸的产量有显著性差异（p＜0.05），该5 株菌都是在五粮粉液培养基中产丁二酸能力最强，其次是麦芽汁液体培养基，YPD液体培养基中丁二酸产量最低。菌株Y4 在五粮粉液培养基中丁二酸产量最高，可高达478.8 mg/L。五粮粉液中葡萄糖含量较高，通过葡萄糖代谢提高了丁二酸的糖酸转化率[18]，但对于此5株菌在五粮粉液培养基中产丁二酸能力最强的原因目前尚未完全弄清楚，还有待于进一步研究。菌株Y4 为Naumovozyma castellii，为产乙醇酵母，其在五粮粉液培养基中产乙醇能力较强，应该是通过乙醇合成丁二酸途径产丁二酸。

图3 5株菌在不同培养基中丁二酸的产量

3 结论

从五粮液酿造环境中分离到5 株不同属的酵母菌株，此5 株酵母菌用26S rDNA 序列可以鉴定到种，分属于Kazachstania bulderi、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Naumovozyma castellii、和Saccharomycopsis fibuligera5 个不同的属；5 株不同属酵母菌在3 种不同培养基中产丁二酸的能力有明显不同，在五粮粉液培养基中产丁二酸能力均为最强，其次是麦芽汁液体培养基，YPD液体培养基中丁二酸产量最低。其中，菌株Y4（Naumovozyma castellii）在五粮粉液培养基中丁二酸产量最高。