HS-SPME-GC-MS 联用分析广东刺芫荽挥发性成分

曾自珍 钟倪俊 李晓燕 梁 齐 文桂卿 钟兰英 王利胜

1.广州医科大学附属第六医院 广东省清远市人民医院药学部，广东清远 511518；2.广州中医药大学中药学院，广东广州 511400

刺芫荽（Eryngium foetidum L.）别名刺芹、野芫荽、假芫荽，是伞形科刺芹属多年生草本植物，广泛分布于墨西哥、孟加拉、泰国、拉丁美洲、加勒比等国家和地区，被当地人作为食用蔬菜及用于治疗感冒、咳嗽、哮喘等疾病[1]。在中国主要分布于广东、广西、云南、海南等热带及亚热带地区[2-3]。经现代药理学证明，刺芫荽具有抗炎[4]、抗氧化[5]等生物活性，挥发油、多糖[6]及黄酮类化合物[7]、酚酸类化合物[8]是其主要的活性成分。

国内最早对刺芫荽挥发油成分进行分析的是官智等[9]，认为壬醛与葵醛是主要成分；高燕等[10]在2013 年对云南刺芫荽挥发油再次进行分析，结果发现2-十二碳烯醛（45.24%）、2，4，5-三甲基苯甲醛(6.15%)为主要成分，葵醛只占1.72%；翟锐锐等[11]对海南刺芫荽全草挥发油进行研究，其主要成分为十二烯醛（22.18% ）、2，4，5-三甲基苯甲醛（14.27%）和1，11-十二二烯（11.15%），葵醛相对含量只有0.36%。由此可见，不同产地的刺芫荽同一物质的含量以及含有物质的种类有所不同。因此，要充分利用刺芫荽的药用价值，应要将产地因素考虑在内。

固相微萃取（SPME）是Arther 和Pawliszyn[12]在1990 提出的一种新型样品前处理技术，其是基于气固吸附和液固吸附平衡的富集方法，活性固体表面能对分析物有一定吸附能力，从而达到分离富集的目的，具有操作简便、耗费时间少、无须溶剂和效率高等优点[13]，被广泛用于药品[14-15]、食品[16-17]和环境分析[18-19]等领域。

目前尚未见文献有对广东产地的刺芫荽进行挥发性成分分析，本研究采用顶空固相微萃取法联合气相色谱-质谱对其挥发性成分进行分析，为其挥发性成分体内外药理活性研究和合理开发利用提供重要依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

仪器：安捷伦7890B-5977A 气相色谱-质谱（GCMS）联用仪（美国安捷伦公司）；HP-5MS 色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（美国安捷伦公司）；SPME-GC 萃取手柄（美国Supelco 公司）；SPME 专用磁力加热搅拌器（美国Supelco 公司）；固相微萃取纤维头聚二甲基硅氧烷PK3（PDMS，100 μm）、聚丙烯酸酯PK3（PA，85 μm）、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯PK3（PDMS/DVB，65 μm）（美国Supelco 公司）；电热恒温鼓风干燥箱XHDHG-系列（上海宵汉实业发展有限公司）；四两装高速中药粉碎机型号105（瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试药

广东刺芫荽药材（采自广东省清远市地区）经清远市人民医院药学部鉴定为广东刺芫荽。

2 方法与结果

2.1 样品处理

将新鲜刺芫荽洗净，置于60℃烘箱烘干，经粉碎机粉碎后过4 号筛，备用。

2.2 气相色谱条件

HP-5MS 色谱柱，柱流量1.0 mL/min；进样口温度250℃；程序升温从80℃开始，以4℃/min 升至200℃，再以8℃/min 升至250℃，保持5 min；分流比20∶1。

2.3 质谱条件

电离源为EI 离子源；电离电压70 eV；离子源温度230℃；扫描范围10～500 aum；溶剂延迟3 min。

2.4 固相微萃取条件的优化

2.4.1 萃取头种类的选择 在装样量0.5 g，温度170℃，平衡时间10 min，萃取时间10 min，解吸附时间3 min 条件下，考察100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB 3 种萃取头的萃取能力，以出峰数目为指标进行筛选，结果分别为100 μm PDMS 出峰54 个，85 μm PA 47 个，65 μm PDMS/DVB 35 个。因此，选择100 μm PDMS 作为进行下一步实验的萃取头。

2.4.2 平衡温度的考察 选取80℃、120℃、150℃、170℃4 个温度作考察。温度的提高能增加挥发性成分的浓度，有利于萃取；另一方面，萃取是放热反应，温度过高会使已经被吸附的物质脱落。4 个温度梯度的出峰数分别为31、42、48、54 个。170℃下测得挥发性成分数目较多，选取此温度作为平衡温度。

2.4.3 平衡时间的考察 考察平衡时间为10、20、30 min，其余条件按“2.2”“2.3”项下不变。10、20、30 min 出峰数分别为54、56、60 个。平衡30 min 后出峰数目最多，选择30 min 为平衡时间。

2.4.4 萃取时间的考察 实验选定10、20、30 min 萃取时间进行考察，以出峰数为指标。出峰分别为60、61、69 个。萃取30 min 出峰数有明显的提高，所以选取30 min 为萃取时间。

2.5 固相微萃取

将称量好的0.5 g 样品装入带有聚四氟乙烯隔垫的顶空瓶，置于170℃磁力搅拌器平衡10 min。平衡完毕后将萃取头插入顶空瓶中，推出萃取头，萃取10 min。萃取结束后于250℃GC-MS 进样口解吸附3 min。每次取样前将萃取头在250℃下老化10 min。

2.6 广东芫荽挥发性成分分析

通过峰面积归一化法计算广东刺芫荽中各挥发性成分的相对峰面积，并使用NIST14.L 谱库检索鉴定各个化合物结构与名称。

2.7 广东刺芫荽挥发性成分分析

综合上述结果，广东刺芫荽最佳分析条件为使用PDMS 萃取头，装样量0.5 g，平衡温度170℃，平衡时间30 min，萃取时间30 min。分析结果见图1、表1，主要挥发性物质见图2。

图1 广东刺芫荽挥发性成分TIC 总离子流图

图2 广东刺芫荽主要挥发性成分

表1 广东刺芫荽挥发油化学成分分析结果

2.8 云南、海南刺芫荽挥发性成分分析及与广东刺芫荽相同成分

使用“2.7”项下分析广东刺芫荽固相微萃取条件，对云南、海南产地刺芫荽成分进行分析。结果见图3～4，云南、海南二产地与广东刺芫荽相同挥发性成分见表2。

图3 云南刺芫荽挥发性成分TIC 总离子流图

图4 海南刺芫荽挥发性成分TIC 总离子流图

3 讨论

3.1 广东刺芫荽主要成分

3.1.1 萃取温度的选择 在海南和云南刺芫荽中含量占比最高的是十二烯醛，分别为22.8%和45.24%，此类含量高的长链醛类在广东刺芫荽中也含有，为十二醛，在本研究中占比8.41%，含量不及海南和云南刺芫荽中的高，经分析原因可能为平衡温度较高，一方面会造成已被吸附的小分子挥发性物质会部分脱落，不利于小分子挥发性物质的吸附；另一方面温度的升高会使其他挥发性物质的含量增加，十二醛的占比也有相应的减少。温度在120℃和150℃以下，十二醛相对百分含量为26.8%和18.8%，皆为含量占比最高的物质。综合分析，广东刺芫荽的主要挥发性物质为1-2，6，6-三甲基-1，3-环己二烯基醇和十二醛。在80℃、120℃、150℃下，出峰数较少，虽然十二醛比例占比最高，但是检测到的挥发性物质种类比170℃下少，因此综合考虑选择170℃为平衡温度。

3.1.2 广东、海南、云南三地刺芫荽主要成分的比较 广东刺芫荽挥发性成分最高为酚醇类（41%），其次为醛酮（24%）和烯烃（22%）；云南刺芫荽挥发油主要为醛酮类（58.05%）烯烃只占5%，海南刺芫荽挥发油成分主要为烷酸类（26%），其次为醛酮类（23%），烯烃占总挥发油成分13%。从表2 分析结果得知，云南刺芫荽与广东刺芫荽相同的成分有15 种，而海南刺芫荽则有24 种，且从相对含量上看，海南产地刺芫荽与广东刺芫荽更为接近。

表2 云南、海南与广东刺芫荽共有挥发性成分对比结果（%）

3.1.3 广东刺芫荽中主要成分的作用 十二醛呈无色至透明油状液体，具有强烈脂肪香气，类似松叶油和橙油的强烈香气，是刺芫荽的香气主要成分；据文献报道，反式-2-十二烯醛是一种高效的神经元电压门控钾离子通道激活剂，具有抗癫痫作用[20]；石竹烯属于双环倍半萜，具有抗炎、抗肿瘤、神经保护、减轻脑缺血再灌注损伤的作用[21]；β-榄香烯是一种新型的抗癌药，具有抗肿瘤、增强免疫[22-23]和抗粥样动脉硬化[24]作用。

3.1.4 HS-SPME-GC-MS 联用法与传统提取方法比较水蒸气蒸馏法提取时间长，加热温度高，可能会造成含量小的物质损失[25]；与其他方法相比，SPME 法能测定更多的成分[26]。SPME 法是根据相似相溶原理，不同涂层的萃取头对不同物质的亲和力不同，从而达到富集样品挥发性成分的目的，具有样品用量少、加热温度低、加热时间短的特点[27]，能够方便快捷、更全面反映挥发性物质成分的优点[28]。文献[10-11]采用的水蒸气蒸馏法和同时蒸馏萃取法，鉴定出刺芫荽的成分分别为38 和24 个，而本研究采用HS-SPME 法鉴定的刺芫荽挥发性成分有55 个，对挥发性成分的提取大有提高。本研究采用HS-SPME-GC-MS 法对广东刺芫荽挥发性成分进行分析，并与不同产地的刺芫荽进行挥发性成分比较，发现可能的具有药理作用的物质，为广东刺芫荽的挥发性成分的研究和开发利用提供重要的依据。