结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c在结核病血清学诊断中的价值

韩俊垒，胡建平，边红芝

（河南省胸科医院 呼吸内科，河南 郑州 450002）

结核病是一种传染性疾病，在世界范围内均广泛流行，对人类身体健康有着严重的负面影响，特别是在发展中国家，疾病带来的影响更为明显。据统计，结核分枝杆菌在人群中潜伏性感染率约为1/3，我国国内结核病的年新增病例数约为130万例，在全世界结核病患病总例数中占比约为14%，居第二位，可见我国结核病发病的严峻性[1]。目前，结核病的主要感染源依然是活动性肺结核，故早期鉴别诊断活动性肺结核与潜伏性肺结核对结核病的有效控制极为关键[2]。结核病主要的诊断方法包括血清学、细菌学与分子生物学三种，其中血清学诊断具有价格低廉、操作简单、无需借助精密仪器、可在基层医院展开等诸多优点，但其仍存在缺乏高效价特异性抗原、灵敏度低等局限[3,4]。故越来越多的研究关注相关抗原蛋白融合表达或多种抗原联合诊断在结核病血清学诊断中的应用价值。本研究基于上海交通大学医学学员国家“十二五”专项研究，通过在国际上首次引入仿生亲和免疫组学，筛选出4个候选蛋白T细胞新型标志物（Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c），分析这些蛋白抗原用于辅助结核病血清学诊断的价值，旨在为未来结核特异性T细胞检测的临床诊断及疫苗设计提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 纳入对象 选择我院2016年12月-2018年12月河南省胸科医院结核科与呼吸科接诊的234例活动性肺结核患者作为结核组；选择同期我院接诊的非结核病其他肺部疾病者128例作为其他肺部疾病组；选择同期河南省中医学院一附院接受常规体检的110例健康人群作为健康组。结核组患者均符合《肺结核诊断和治疗指南》[5]中相关诊断标准：⑴有咳嗽、咯血、咳痰、发热、纳差、盗汗、疲倦、体重减轻、头痛、胸痛、呼吸急促等结核病主要症状；⑵胸部CT或X线证实存在结核病变；⑶痰培养或涂片结果为阳性；⑷支气管镜检查确诊；⑸PPD强阳性；⑹抗结核治疗有效；⑺病理确诊。其他肺部疾病组患者有咳嗽、咳痰等表现，但均接受相应检查排除结核病或经一段时间抗结核治疗无效；健康组人群均经全身体检证实为健康人，无结合病史或其他肺部疾病史。排除：⑴合并血液系统疾病者、恶性肿瘤疾病者、免疫系统疾病者；⑵合并肝肾功能衰竭者；⑶合并精神疾病或心理障碍等无法很好的配合研究者。本次研究的设计获得我院伦理委员会批准同意，且全部入选者及其家属对此次研究设计的内容均知情，并签署知情同意书。

1.2 一般资料 结核组男性患者131例，女性患者103例；年龄38～65岁，平均（48.12±5.11）岁；体质量44～75kg，平均（60.21±6.31）kg；受教育程度：75例小学及以下，109例初中或中专，50例高中及以上。其他肺部疾病组男性患者72例，女性患者56例；年龄40～65岁，平均（49.11±5.27）岁；体质量45～74kg，平均（61.11±6.21）kg；受教育程度：41例小学及以下，60例初中或中专，27例高中及以上。健康组男性61例，女性49例；年龄36～65岁；平均（47.84±5.81）岁；体质量45～75kg，平均（61.02±6.01）kg；受教育程度：35例小学及以下，51例初中或中专，24例高中及以上。3组纳入者性别、年龄、体质量、受教育程度等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。

1.3 方法

1.3.1 实验主要试剂与材料 购自上海奥普生物医药有限公司结核抗体检测试剂盒，采用胶体金法。购自天津希恩思生化科技有限公司的辣根过氧化物酶；北京科科跃中楷生物技术公司提供的化学发光底物液；北京索莱宝科技提供的吐温-20 500mL，杭州四季青生物工程提供无支原体新生牛血清；中国医药公司提供碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钠、氯化钾。

1.3.2 配制试剂 包括抗原包被液、磷酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液。

1.3.3 主要仪器SANYO提供的MCO-15AC型37°培养箱；北京东联哈尔仪器提供的BCN-1360型生物洁净工作台；德国BRAND提供的移液器；北京科美东雅提供的化学发光仪；北京拓普仪器提供的DEM-3型全自动洗板机；德国eppendorf提供的5418xp811917型离心机。

1.3.4 结核分枝杆菌重组蛋白抗原的测定 严格按照各试剂盒操作要求，同时严格根据《结核病诊断实验室检验规程》进行相关的操作[6]。主要操作包括：筛选各抗原阳性血清标本、确定最佳酶标二抗稀释度、确定各抗原最佳包被浓度、采用化学发光酶免疫测定法（CLEIA法）测定血清内抗结核抗体、使用试剂盒测定血清内抗结核抗体、涂片培养。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件处理数据，以表示计量资料，用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，以百分比表示计数资料，用χ2检验，绘制受试者工作曲线，以特异性为90%时的抗原水平发光值作为结核病诊断临界值，计算各抗原的灵敏度与特异性，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人群血清各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较 经化学发光酶免疫法测定血清结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c水平表达结果显示，结核组患者各血清结核分枝杆菌蛋白抗原水平表达最高，后由高至低依次为其他肺部疾病组、健康组，结核组与其他两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其他肺部疾病组与健康组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组人群血清各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较（）

表1 3组人群血清各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较（）

注：a：与结核组比较，P＜0.05。

组别 Rv2041c（pg/ml） Rv1419（pg/ml） Rv2991（pg/ml） Rv3428c（pg/ml）结核组（n=234）其他肺部疾病组（n=128）健康组（n=110）FP 152714.36±25021.11 38421.02±4369.77a 36421.47±7761.42a 2372.197＜0.001 191712.79±28710.21 31201.31±4321.84a 25714.49±4601.24a 3740.966＜0.001 114910.96±9261.45 27510.56±2611.45a 24301.45±4114.17a 9637.433＜0.001 190310.46±21001.22 41621.22±7071.44a 37210.47±5000.12a 5761.978＜0.001

2.2 结核病组痰菌阴性与痰菌阳性者各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较 全部234例结核组患者中,检出痰菌阳性者168例,占比为71.79%,其他66例均为痰菌阴性，阴性率为28.21%。痰菌阴性组与痰菌阳性组各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 结核病组痰菌阴性与痰菌阳性者各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较（）

表2 结核病组痰菌阴性与痰菌阳性者各结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达比较（）

组别 Rv2041c（pg/ml） Rv1419（pg/ml） Rv2991（pg/ml） Rv3428c（pg/ml）痰菌阴性组（n=66）痰菌阳性组（n=168）t P 141567.41±24125.37 146962.47±25241.45 1.490 0.138 184597.78±30214.56 190214.11±31457.89 1.243 0.215 109689.88±90145.69 121567.41±93021.44 0.887 0.376 185697.89±22457.15 192144.73±30001.21 1.580 0.116

2.3 4种结核分枝杆菌重组蛋白抗原水平表达在结核病血清学诊断中的ROC曲线分析

2.3.1 Rv2041c在结核病血清学诊断中的ROC曲线分析 以敏感性作为纵坐标、特异性作为横坐标绘制ROC曲线（见图1），以特异性为90%时Rv2041c发光值为69657.50作为结核病诊断阳性临界值，在全部234例结核病患者中，阳性者165例，灵敏度为70.51%（165/234）；128例其他肺部疾病患者中，阳性者17例，特异度为86.72%（111/128）；110例健康组人群中，阳性者14例，特异度为87.27%（96/110）。整体特异度分别为86.97%。

图1 Rv2041c检测的ROC曲线图

2.3.2 Rv1419在结核病血清学诊断中的ROC曲线分析 以敏感性作为纵坐标、特异性作为横坐标绘制ROC曲线（见图2），以特异性为90%时Rv1419发光值为45650.50作为结核病诊断阳性临界值，在全部234例结核病患者中，阳性者173例，灵敏度为73.93%（173/234）；128例其他肺部疾病患者中，阳性者22例，特异度为82.81%（106/128）；110例健康组人群中，阳性者14例，特异度为87.27%（96/110）。整体特异度为84.87%。

图2 Rv1419检测的ROC曲线图

2.3.3 Rv2991在结核病血清学诊断中的ROC曲线分析 以敏感性作为纵坐标、特异性作为横坐标绘制ROC曲线（见图3），以特异性为90%时Rv2991发光值为41250.50作为结核病诊断阳性临界值，在全部234例结核病患者中，阳性者176例，灵敏度为75.21%（176/234）；128例其他肺部疾病患者中，阳性者17例，特异度为86.72%（111/128）；110例健康组人群中，阳性者14例，特异度为87.27%（96/110）。整体特异度为86.97%。

图3 Rv2991检测的ROC曲线图

2.3.4 Rv3428c在结核病血清学诊断中的ROC曲线分析 以敏感性作为纵坐标、特异性作为横坐标绘制ROC曲线（见图4），以特异性为90%时Rv3428c发光值为71569.50作为结核病诊断阳性临界值，在全部234例结核病患者中，阳性者159例，灵敏度为67.95%（159/234）；128例其他肺部疾病患者中，阳性者15例，特异度为88.28%（113/128）；110例健康组人群中，阳性者14例，特异度为87.27%（96/110）。整体特异度为87.82%。

图4 Rv3428c检测的ROC曲线图

3 讨论

结核病细菌学检查是结核病诊断金标准，但在临床实际中，标本的涂片、镜检灵敏度较低[7,8]。血清结核抗体检测具有标本来源方便、操作简单方便、检测结果快速等优点，现被广泛用于临床，但灵敏度、特异度仍较低[9]。因此近几年国内外相关研究将研究方向转至蛋白抗原融合表达与多种蛋白抗原联合检测上。

Alito等[10]在2003年的研究结果指出，有接近90%的患者其血清内存在至少1种结核抗体，且患者体内抗体表达的种类、数量与水平可以随着患者疾病不同阶段、免疫背景与菌株的不同而有明显区别。结核病抗体反应针对的结合抗原是多种多样的，任何抗原单独检测均无法完全测定结核病患者全部的血清结核抗体，故联合检测多种抗原，可以在确保特异性的基础上帮助诊断敏感性提高[11,12]。本研究就主要的4种结核分枝杆菌重组蛋白抗原（Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c）用于结核病血清学诊断的价值进行相关研究。

结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c基因（ID 887474）编码蛋白质主要由439个氨基酸残基所组成，属糖脂蛋白，主要由结核分枝杆菌H37Rv在体外缺氧、低pH的条件下高效表达产生[13,14]。本研究结果显示，结核分枝杆菌Rv2041c可诱导结核病患者分泌高水平抗体，这与Garmory等[15]研究结果一致。本研究单独将结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c用于结核病的血清学诊断，结果显示，该蛋白测定结核抗体特异度为86.97%，有着较高的特异度，可见结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2041c是一种相对理想的结核病血清学诊断抗原。Rv1419是凝集素的一种，主要由结核分枝杆菌所分泌，是一种糖蛋白，仅在结核分枝杆菌复合群内有表达，在其他的分枝杆菌中午表达[16-18]。Singh等[19]在2007年采用生物信息学鉴定并分析了分枝杆菌主要的11种凝集素，结果证实，Rv1419的分子量最小，该研究还证实了Rv1419会引起兔红细胞的凝集，并对活性肺结核患者外周单核核细胞产生刺激，导致其γ-干扰素处于高水平；此外，该研究还在活动性肺结核患者的外周血中检测除了高滴度抗Rv1419 IgG抗体，而在给予患者合理的抗结核治疗后，其对应的抗体滴度降低。可见Rv1419对结核病评价的重要意义。本研究所得结果与上述研究结果一致，表明结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv1419可以刺激结核病患者抗体呈高水平状态，该抗原用于结核病诊断的灵敏度与特异度均理想，可考虑将其用于结核病的血清学诊断中。Rv2991与Rv3428c是近几年新发现的结核分枝杆菌重组抗原蛋白类型,前者已被证实用于结核病早期诊断有一定价值,且在特定的灵敏度下,其用于结核病血清学诊断的特异度相对较高[20]。该结果与本研究所得结果一致。目前，与结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv3428c用于结核病血清学诊断的相关研究国内外均不多见,该蛋白抗原的相关机制、分子量等情况也尚未明确，本研究结果显示，将Rv3428c蛋白抗原用于结核病血清学诊断的特异度为87.82%，特异度较高，可以考虑将其与其他抗原蛋白联合使用，以提高结核病早期鉴别诊断准确率。但因上述结核分枝杆菌重组蛋白抗原用于结核病早期血清学诊断相关循证学依据较少，故本研究中所得的结果与结论还应在未来进一步展开大样本、长时间的研究加以证实。

综上所述,结核分枝杆菌重组蛋白抗原Rv2 041c、Rv1419、Rv2991、Rv3428c辅助结核病的血清学诊断均有着较高的特异度，临床实际中，可将各抗原联合检测，以提高抗结核抗体检测敏感度，提高结核病的检出率。