白术对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆和抗氧化能力的影响

翟春梅,薛迎凤,郭鹏飞,白晨曦,石雅维,孟永海,高利权

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

本文采用穿梭实验视频分析系统，考察白术对D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠的学习记忆能力的影响，再结合体质量、脏器指数及血清SOD、GSH-Px，CAT和T-AOC活力等指标，系统阐述白术对衰老产生的学习记忆能力影响特征，从而进一步揭示白术的抗衰老作用机制。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

CT15RE型高速粉碎离心机(日本日立); OSB-2200型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司); AL 204电子天平(美国METTLER TOLEDO公司); KQ-5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); EVOLUTION260型紫外分光光度计(美国赛默飞公司); ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统Shuttle box system(徐州利华电子科技发展有限公司)。

1.2 实验试剂

超氧化物歧化酶试剂盒(批号：20190519)，谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(批号：20190621)，总抗氧化能力试剂盒(批号：20190519)，过氧化氢酶试剂盒(批号：20190723)，以上均试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；抗坏血酸(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20191125); D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180125)。

1.3 实验动物及分组

选取KM小鼠36只(雄性)，随机分至空白组、模型组、白术水提取液高、中、低剂量组和阳性药组。适应性喂养7 d，昼夜12 h交替照明。

2 实验方法及观察指标

2.1 灌胃药液制备

称取2.4 kg白术生品粉碎成小块，加10倍量水浸泡2 h，煎煮3 h，将滤液浓缩后旋蒸干溶剂，得到白术干膏，出膏率为35%，将浸膏溶于一定量蒸馏水，得到灌胃药液。

2.2 D-半乳糖致衰老模型的建立

D-半乳糖模型组、白术高、中、低剂量组和抗坏血酸阳性药组小鼠每日腹腔注射250 mg·kg-1的D-半乳糖溶液，空白组小鼠每日腹腔注射等量的生理盐水。造模同时阳性药组每日给予抗坏血酸100 mg·kg-1，高剂量组每日给予干膏2.80 g·kg-1，中剂量组每日给予药液1.68 g·kg-1，低剂量组每日给予药液0.56 g·kg-1。造模并给药共计5周[13-17]。

2.3 一般状态观察

观察各组小鼠日常状态，包括饮水、摄食、粪便、活动度、毛皮光泽度变化等方面，进行组间比较。从第0周开始每周记录小鼠体质量。

2.4 脏器指数测定

各组小鼠禁食12 h后，称取各组小鼠的空腹质量，将经过采血处理后的小鼠脱颈处死，在冰上进行解剖，依次取出小鼠脾脏、肝脏组织，在冷的生理盐水中漂洗除去血液后，剥离脂肪组织和结缔组织，滤纸吸干表面水分，称重记录，计算脏器指数。

三相并网逆变器的MPDPC策略如图3所示,不同的电压矢量产生不同的有功和无功功率变化,因此,存在多种方式去选择合适的开关状态去控制有功和无功功率。采样三相电网电压和电流,分别在8个矢量的作用下计算出下一周期的功率预测值,将预测值代入式(9),根据误差最小化原则,选取最优矢量。p*由直流电压外环PI调节器的输出与直流电压的乘积给定,q*通常设为0,以实现单位功率因数运行。

2.5 行为学评价

在给药及造模的最后1周，进行穿梭箱实验。将小鼠置于穿梭箱中，小鼠适应5 min消除探索反射，给予嗡鸣刺激5 s后,随即给予电刺激10 s，每次训练间隔10 s，共训练30次，共3 d，通过小鼠主动躲避次数和被动躲避次数与无反应次数考察D-半乳糖致衰小鼠灌服白术提取液后习得能力。

2.6 血清抗氧化能力测定

D-半乳糖腹腔注射造模5周后，在最末次给药后12 h，摘取小鼠眼球取血，取出的小鼠血液于冰上静置1 h，离心10 min(3 500 r·min-1)，吸取上层血清，于-80 ℃冰箱中保存。按照超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明进行指标测定。

2.7 统计学方法

3 实验结果

3.1 一般状态观察结果

对小鼠进行日常观察，总结小鼠日常状态观察表如表1所示。模型组小鼠在摄食、饮水方面出现了减少，毛皮晦暗不顺滑、无光泽，并出现掉毛现象，精神状态差，活动不活跃，出现了便溏的现象，提示经过D-半乳糖腹腔注射的小鼠出现了一系列衰老现象。与空白组小鼠对比，阳性药组小鼠整体活跃、活动灵敏、饮水多、毛皮光亮顺滑。给药组小鼠在造模前期出现了便溏，提示可能D-半乳糖导致小鼠产生全身性的衰老，肠道渗水利湿能力不足，药效短期内不显著。随着给药日期的延长，给药组小鼠逐渐恢复正常排便。

表1 小鼠一般状态观察表(n=6)

小鼠0至5周体质量测量见表2。结果显示，当连续通过腹腔注射给予KM小鼠D-半乳糖(250 mg·kg-1)溶液5周，模型组小鼠体质量较高剂量组、中剂量组、阳性药组小鼠产生极显著性(P<0.01)降低；低剂量组小鼠第5周平均体质量较模型组小鼠发生显著性(P<0.05)回调。当给予给药组小鼠白术水提取物后，在体质量方面，第5周各组小鼠平均体质量从大到小依次为：阳性药组>高剂量组>空白组>中剂量组>低剂量组>模型组，结果表明，连续给予小鼠5周白术水提取液，可改善由于D-半乳糖致亚急性衰老伴随的体质量减轻现象。

表2 小鼠5周内体质量变化表

小鼠内脏指数见表3。通过各组小鼠内脏指数表可以得出：模型组小鼠脾脏指数、肝脏指数升高，通过解剖发现，模型组小鼠存在内脏粗糙、质地略硬、脏器淤血等情况，提示腹腔注射D-半乳糖可导致小鼠脏器的衰老。阳性药组脾脏指数最高，其次为高剂量给药组，较模型组具有显著性差异(P<0.05)，提示给予小鼠白术水提取液可抵抗D-半乳糖导致的亚急性衰老与亚急性炎症，提高机体抵抗力。

表3 小鼠内脏指数

3.2 白术对小鼠穿梭实验行为学评价结果

各组小鼠主动逃避次数、被动逃避次数、无反应次数的行为学数据结果图1～3，数学模型检验结果见表4。表明经过3 d的训练，模型小鼠主动躲避次数增加幅度较小，提示给予小鼠D-半乳糖5周后，出现明显的学习能力下降现象。穿梭实验行为学研究结果表明：给予小鼠白术水提取液后可改善D-半乳糖致衰老小鼠学习能力下降与反应能力下降的现象。

表4 白术对衰老小鼠穿梭实验学习记忆能力的影响次)

图1 白术对衰老小鼠穿梭实验主动躲避次数对比图

图2 白术对衰老小鼠穿梭实验被动逃避次数对比图

3.3 对衰老小鼠血清SOD活力测定结果

小鼠血清SOD活力影响数据及分析，见表5。结果表明：SOD活力测定结果，高剂量组略大于空白组且大于阳性药组(P<0.01)，与模型组小鼠血清SOD活力相比具有极显著性差异；中剂量与低剂量组均大于模型组小鼠血清SOD活力(P<0.05)，具有显著性差异，白术给药提高小鼠SOD活性并呈现剂量依赖性影响，结果显示白术可有效提高衰老小鼠血清SOD活力，提升小鼠血清超氧化物歧化酶活性。

表5 小鼠血清SOD活力测定

3.4 小鼠血清测定结果

小鼠血清GSH-Px活力影响数据及分析，见表6。GSH-Px活力测定结果显示，空白组与阳性药组小鼠血清GSH-Px活力相差不大，高剂量组略大于空白组与阳性药组小鼠血清GSH-Px活力，且大于阳性药组。高剂量组、中剂量组、阳性药组、空白组与模型组小鼠血清GSH-Px活力相比具有极显著性差异(P<0.01)；低剂量组小鼠血清GSH-Px活力大于造模组(P<0.05)，具有显著性差异，提示白术水提取液可有效提高小鼠血清GSH-Px活力，提升谷胱甘肽过氧化物酶活性。

表6 小鼠血清GSH-Px活力测定

3.5 小鼠血清CAT活力测定结果

小鼠血清CAT活力影响数据及分析，见表7。CAT活力测定结果显示，高剂量组CAT活力大于空白组且大于阳性药组小鼠血清CAT活力，高剂量组、中剂量组、阳性药组、空白组小鼠与模型组小鼠血清CAT活力相比具有极显著性差异(P<0.01)；低剂量组与模型组相比，CAT活力大于模型组，具有显著性差异(P<0.05)，提示白术水提取液可有效提高小鼠血清CAT活力，提升过氧化氢酶活性。

表7 小鼠血清CAT活力测定

3.6 小鼠血清T-AOC活力测定结果

小鼠T-AOC活力影响数据及分析，见表8。各组T-AOC活力测定结果显示，高剂量组T-AOC活力大于阳性药组且大于空白组T-AOC活力，中剂量与低剂量组T-AOC活力均大于造模组。高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药组小鼠血清T-AOC活力与模型组相比，具有极显著性差异(P<0.01)；空白组血清T-AOC活力大于模型组小鼠血清T-AOC活力，具有显著性差异(P<0.05)，提示白术水提取液可有效提高小鼠血清T-AOC活力，提升总抗氧化能力。

表8 小鼠血清T-AOC活力测定

4 讨论与小结

机体衰老过程涉及许多内外因素，活性氧自由基(ROS)是在衰老过程中最常见的内源性生化因子。生物体在生长过程中，ROS在机体内不断积累，过量ROS抢夺细胞蛋白分子的电子，使蛋白质接上支链发生烷基化，导致细胞结构和功能的损伤。而机体相关抗氧化酶类如SOD、GSH-Px和CAT等活性的下降使机体清除自由基的能力下降。机体内脂褐素含量为衰老的客观依据之一，其形成与脂质自由基有关，衰老生物体内血清脂质自由基水平显著增高，组织内脂褐素含量增多。活性氧能与生物膜中不饱和脂肪酸形成过氧化脂质，引起神经元细胞损伤，导致机体功能下降，产生如阿尔茨海默病、帕金森病等相关衰老性疾病[18]。

D-半乳糖造成的动物衰老模型接近于自然衰老特征，是当前世界公认的应用衰老和脑老化动物模型。D-半乳糖在体内代谢能产生大量的ROS，是其导致衰老的一个重要机制，D-半乳糖可使其代谢产生的过量氧自由基导致过氧化产物MDA升高，氧自由基的过量积累也会使致脑组织中清除自由基酶类活性下降，实验动物出现认知功能障碍[17]。

本实验中小鼠亚急性衰老模型由腹腔注射D-半乳糖溶液的方法建立，同时进行给药与造模共5周，给予阳性药组小鼠抗坏血酸溶液。伴随着造模时间的延长，模型组小鼠出现了便溏、食欲减退、行动不活跃、毛皮无光泽且掉毛的衰老现象，当给予白术水提取液时间逐渐延长，阳性药组小鼠与给药组小鼠的便溏得到了充分缓解，食欲增强，体质量增加，逐渐改善掉毛现象，毛皮逐渐变得顺滑光泽。在行为学考察中，如图1～图3所示，经过3 d的训练，模型小鼠主动躲避次数增加幅度较小，提示给予小鼠D-半乳糖5周后，出现明显的学习能力下降现象，出现衰老认知功能障碍。给与高、中剂量白术药物组及阳性药物组的无反应次数较少(P<0.01)，而主动逃避次数较多(P<0.05)，结果表明白术可改善D-半乳糖致衰老导致的记忆减退与学习能力、反应能力下降，体现抗衰老作用。

图3 白术对衰老小鼠穿梭实验无反应次数对比图

在模型动物抗氧化研究中，高剂量白术组小鼠血清中SOD活力略大于空白组与阳性药组小鼠血清SOD，中剂量与低剂量小鼠血清SOD活力均大于模型组；空白组小鼠血清GSH-Px活力与阳性药组活力相近，高剂量组小鼠血清GSH-Px活力略大于空白组与阳性药组，且大于低性药组，中剂量与低剂量组小鼠血清GSH-Px活力均大于造模组；高剂量组小鼠血清CAT活力大于空白组且大于阳性药组小鼠血清CAT活力，中剂量与低剂量组小鼠血清CAT活力均大于造模组；高剂量组小鼠血清T-AOC活力大于阳性药组且大于空白组小鼠血清T-AOC活力，中剂量与低剂量组小鼠血清T-AOC活力均大于造模组。抗氧化研究表明白术对D-半乳糖导致的亚急性衰老显示出非常好抗氧化活性，可显著提高机体SOD、GSH-Px、CAT及T-AOC活力，对抗ROS对机体细胞的损伤，从而改善模型小鼠的记忆等认知功能的障碍。

本研究对白术的改善学习记忆能力及抗衰老作用进行了初步研究，结果提示白术是通过清除机体内活性氧、抵抗氧化应激造成的机体损伤这一机制来发挥抗衰老作用。表明白术可通过提高机体抗氧化功能而改善D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠的学习记忆等认知障碍。本研究为白术作为具有改善学习记忆能力的抗衰老药物应用于临床提供了重要的实验数据。