五加生化胶囊对早孕大鼠药物流产出血干预作用的代谢组学研究

张宁，方衡，张爱华，闫广利，祁永华，李贵森，王发善，王喜军*

(1.黑龙江中医药大学 国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物 化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药 大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；3.多多药业有限公司，黑龙江 佳木斯 154002)

五加生化胶囊源于产后圣方《生化汤》[1]，由刺五加、当归、川芎、桃仁、甘草和干姜6味药材组成，功效益气养血、活血化瘀、行气止痛，主治妇女产后恶露不行及妇女气虚血瘀或虚寒夹瘀所致痛经等证[2]。代谢组学作为飞速发展起来的热门技术，是考察机体代谢产物(小分子)随时间动态变化特点的一门新学科[3-5]。相比临床常用的酶学指标检测，具有高效率、速度快、应用广及高灵敏度等特点[6]。目前对五加生化胶囊的研究多集中于临床指标观察及质量控制[7-13]，对其致病机制的研究报道较少。本文首次采用代谢组学方法探讨五加生化胶囊对早孕大鼠药物流产出血干预作用的机制，为中西医临床应用五加生化胶囊治疗药物流产出血提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

180～220 g的Wistar雌性大鼠，购于黑龙江中医药大学GLP实验室，合格证号：SCXK黑2008-004。

1.2 仪器、试剂与药物

Agilent6890N气相色谱仪、5975B质谱仪(美国安捷伦公司)；HP-5 MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，正华生物仪器设备有限公司)；KPJ-1A型烤片机、TSJ-1A型自动组织脱水机、BMJ-1型生物组织包埋机(天津航空机电公司)；Ⅸ-71-21PH型Olympus倒置显微镜(日本Olympus株式会社)；KD-2508型轮转切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA，英国Apollo Scientific有限公司)；三甲基一氯硅烷(TMCS，美国Acros Organics公司)；五加生化胶囊(批号：0911251,多多药业有限公司)；米非司酮片、米索前列醇片(批号：H1095003、H20010456,北京紫竹药业有限公司)。

2 方法

2.1 灌胃药液制备

米非司酮混悬液配制：取米非司酮片3片(25 mg/片)，捣碎溶于75 mL生理盐水中，超声10 min，即得；米索前列醇混悬液配制：取米索前列醇片3片(200 μg/片)，捣碎溶于60 mL生理盐水中，超声10 min，即得；五加生化胶囊混悬液配制：充分研磨五加生化胶囊内容物，过筛后使每毫升混悬液含生药量0.25 g[14]。

2.2 药物流产出血模型

将动情大鼠以王氏造模方法[15]按雌雄比2∶ 1合笼，次日早对阴道涂片进行检查，显微观察到精子即受孕第1天。挑选受孕后大鼠，随机分为4组(8只/组)，即正常组、受孕对照组、模型组和五加生化组。模型组和五加生化组大鼠于实验第7天分别灌胃给予米非司酮和米索前列醇，灌胃剂量0.13 g/kg。

2.3 给药方案

模型组自药物流产第1天起，灌胃给予生理盐水(1 mL/100 g)，连续7 d；五加生化组自药物流产第1天起，灌胃给予五加生化胶囊混悬液(1 mL/100 g)，连续7 d[16]，正常组和受孕对照组灌胃给予蒸馏水。

2.4 样品的采集

2.4.1 血清样品采集

采集血样前禁食不禁水12 h，在实验第1、8,14天眼眶取血，实验结束时下腔静脉取血，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4.2 药物流产出血时间及血样收集

自实验第8天，放置棉球于大鼠阴道内(相隔6 h·次-1·d-1)，观察其是否有血渍，并收集于-20 ℃冰箱。药物流产出血时间为取出棉球无血渍时间距离第1次取出棉球时间。

实验进行至14 d时，将NaOH溶液(5 %，4 mL)加入各组大鼠尾静脉血(0.02 mL)混匀。用5%NaOH溶液浸泡并搓洗收集棉球的血渍，根据出血量适当调整溶液用量并记录。过滤浸提液，分别将大鼠尾静脉血5%NaOH溶液、已过滤的浸提液各4 mL检测其吸光度A值(546 nm)，并计算子宫出血量。

2.5 指标检测

2.5.1 子宫组织病理学检查

实验第14天，用4%中性缓冲多聚甲醛液固定新鲜大鼠子宫组织，经处理后，用苏木素-伊红进行染色，封片后进行显微镜下观察。

2.5.2 血清代谢组学研究

2.5.2.1 样本预处理

取150 μL解冻后血清，加入450 μL甲醇，涡漩3 min，冰水浴10 min后离心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)。取上清液400 μL氮吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)涡漩混匀，70 ℃下反应1 h，加入75 μL衍生化试剂(MSTFA∶ TMCS=100∶ 1)，密封涡漩混匀，70 ℃条件下放置1 h。室温冷却后加150 μL含二十二烷(0.10 mg/mL)的正庚烷涡漩，离心(10 000 r/min，4 ℃，10 min)后取上清液进行GC-MS分析。

2.5.2.2 GC-MS分析

氦气作为载气，流速恒为1.0 mL/min；不分流进样，进样量2 μL，进样口温度为280 ℃；程序升温：开始时85 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至128 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至220 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃保持10 min；EI离子源70 eV；离子源温度：230 ℃，四极杆温度：150 ℃；调谐方式：自动调谐；质量扫描方式及范围：全扫描，50～1 000 aum。

2.6 数据处理

3 结果

3.1 五加生化胶囊对药物流产出血大鼠子宫组织形态的影响

正常组大鼠子宫组织及子宫腔状态均正常；受孕对照组大鼠子宫组织中滋养细胞存在明显；模型组大鼠子宫组织中没有明显的滋养细胞存在，蜕膜细胞呈片状坏死，部分出现核固缩现象，子宫腔含较多瘀血；五加生化组大鼠子宫组织蜕膜细胞存在不明显，子宫腔中不含瘀血。见图1。

3.2 五加生化胶囊对药物流产大鼠子宫出血量及出血时间的影响

如表1所示，与正常组相比，模型组子宫出血量及出血时间显著增加(P<0.01)。与模型组相比，五加生化组子宫出血量明显减少(P<0.05),出血时间显著缩短(P<0.01)。

注：A：正常组；B：受孕对照组；C：模型组；D：五加生化组。图1 大鼠子宫组织形态(HE染色,100×)

表1 大鼠子宫出血量及出血时间

3.3 代谢轮廓分析

见图2，用PCA法分析大鼠血清样本，绘制反映组间离散程度的2D得分图，可视化样本分析结果。

3.4 药物流产出血代谢标记物的确定

如图3所示，采用EZinfo2.0软件针对性的建立正常组和模型组间的OPLS-DA分析，以显示化合物对离散趋势贡献程度，结合对组分有贡献意义的VIP值,确定VIP>1.2为潜在标记物。使用NIST05a质谱数据库检索筛选出来的化合物，为甘氨酸、2-丁烯二酸、丝氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、磷酸甘油酯、L-鸟氨酸、L-赖氨酸、D-半乳糖、L-酪氨酸、D-葡萄糖酸、花生四烯酸、2-单棕榈酸甘油酯，2-单硬脂酸甘油酯和胆固醇等15个潜在代谢标记物。

注：A为实验第1天；B为实验第2天；C为实验第8天。图2 正常组、模型组和五加生化组的PCA分析图

注：K为正常组，M为模型组;A为Score图;B为S-plot图。图3 实验第14天正常组和模型组在OPLS-DA模式下的score、S-Plot图

3.5 潜在生物标记物的相对峰面积

潜在代谢标记物的相对峰面积数值反映了该代谢标记物的含量。正常组、模型组和五加生化组的潜在代谢标记物相对峰面积结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠血清中甘氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、L-酪氨酸(P<0.01)含量和丝氨酸、L-鸟氨酸、胆固醇(P<0.05)含量显著降低，2-丁烯二酸、磷酸甘油酯、L-赖氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、2-单棕榈酸甘油酯和2-单硬脂酸甘油酯相含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，五加生化组大鼠血清中甘氨酸、丝氨酸、氨基丙二酸、L-鸟氨酸、L-酪氨酸、花生四烯酸(P<0.01)，L-焦谷氨酸和胆固醇(P<0.05)含量显著升高，2-丁烯二酸、磷酸甘油酯、2-单棕榈酸甘油酯、2-单硬脂酸甘油酯(P<0.01)、L-赖氨酸，D-半乳糖和D-葡萄糖酸(P<0.05)含量显著降低。

表2 潜在代谢标记物的相对峰面积

4 讨论

从潜在生物标记物的角度来看，给予米非司酮和米索前列醇后，主要影响了动物机体内脂肪酸、糖及氨基酸的代谢。

脂肪酸代谢过程中，肠道菌群代谢对其生物合成和代谢有调控作用，脂肪酸的含量和组成变化会反作用于机体，影响能量供应[17]，导致体温变化从而影响酶的活性作用，继而使氨基酸的代谢发生改变。本实验通过VIP predictive和t检验，共找到相关潜在性标记物15个并对其含量进行了分析，发现与正常组相比，2-羟基丁酸、磷酸甘油酯、L-赖氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖酸，2-单棕榈酸甘油酯和2-单硬脂酸甘油酯含量升高，甘氨酸、丝氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、L-鸟氨酸、L-酪氨酸，花生四烯酸和胆固醇含量降低。实验第14天，在五加生化组中相关潜在生物标记物具有回调趋势。

单硬脂酸甘油酯和单棕榈酸甘油酯是饱和脂肪酸和棕榈酸的代谢产物，服用米非司酮和米索前列醇后，其含量降低，影响了脂肪酸的代谢。花生四烯酸作为一种人体必需的主要分布于机体脂肪、脑、肝脏等器官的不饱和脂肪酸，血栓素和前列素等的合成均能受其影响[18-19]。且花生四烯酸具有调节血小板聚集、平滑肌收缩、炎性细胞因子的产生等一系列生理活性[20]，因此，花生四烯酸的代谢在体内显得尤为重要。口服米非司酮和米索前列醇导致药物流产出血，影响了脂肪酸代谢，其中降低了花生四烯酸在血清中的浓度，影响了大鼠子宫平滑肌的收缩，使蜕膜组织不能顺利排出体外，刺激子宫内膜，使出血时间延长。影响了血液凝固和血液黏度，使子宫出血不止，子宫受损处无法及时修复而导致出血时间延长。

由于药物流产出血对脂肪酸的代谢及糖代谢的影响，使得氨基酸代谢也受到影响。氨基酸代谢需要大量的酶参与，一旦能量代谢途径发生异常，体温会受到很大影响，将直接影响酶的活性，继而影响氨基酸代谢。本实验结果显示，模型组大鼠甘氨酸、鸟氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量明显降低，赖氨酸含量升高，说明药物流产出血影响了氨基酸代谢。而含量变化显著的丝氨酸与本实验密切相关。丝氨酸属于非必需氨基酸，高度集中在所有细胞膜上，在细胞增殖中起着核心作用。丝氨酸合成的数量不足将直接导致细胞的生长受到抑制。药物流产出血后，影响了丝氨酸的代谢，抑制了其合成，受损细胞生长受阻，组织修复缓慢，导致流产出血时间延长，可能是药物流产出血时间长的机制之一。

综上所述，五加生化胶囊可在一定程度上对大鼠的药物产后出血产生治疗作用，其作用可能是通过调节脂肪酸代谢及氨基酸的产生等途径来实现的。本实验对于深入研究和揭示中药复方治疗药物流产出血的多靶点治疗特点和优势具有重要意义。