高效液相色谱法测定白术须根中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量

邵志愿，章 娟，吴德玲,2,3，黄 琪,2,3，张 伟,2,3，许凤清,2,3，赵宏苏,2,3

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；3.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

白术为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎，白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效，临床上主要用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸[1]、水肿、自汗、胎动不安[2]。白术作为大宗药材，平均年需求量约为7 000吨。经过产地调研发现，白术须根较发达，约占根茎总量的10%。按传统加工方法，白术须根为非药用部分需去除，造成了资源浪费，不利于中药资源的可持续发展。现代药理学研究表明，白术中有效活性成分主要是白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等[3]，白术内酯Ⅰ具有较强的增强唾液淀粉酶活性、促进肠管吸收、调节肠道功能的作用，是白术健脾运脾有效成分[4-5]，白术内酯Ⅰ也具有抗肿瘤作用[6]，白术内酯Ⅰ、Ⅲ均具有抗炎活性[7]。本研究以白术须根为研究对象，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定白术须根中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，为白术须根的后续研究及其综合开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 日立天美PM1000液相色谱仪(高压梯度泵、脱气机、自动进样器、柱温箱)：日本；莱芙高速多功能高速粉碎机(LFP-800A型)：浙江省永康市红太阳机电有限公司；MSA6型百万分之一电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；高功率数控超声清洗器(KQ-400KDE型)：江苏省昆山市超声仪器有限公司；美国PALL进口滤膜(0.22 μmol/L)：天津市领航实验设备股份有限公司。

1.2 试药 白术内酯Ⅰ对照品(批号73069-13-3，纯度≥98%)、白术内酯Ⅱ对照品(批号73069-14-4，纯度≥98%)、白术内酯Ⅲ对照品(批号73030-71-4，纯度≥98%)：武汉天植生物科技有限公司；色谱甲醇、乙腈：美国Fisher公司；磷酸等均为分析纯；水为娃哈哈饮用纯净水。

1.3 药材 20批次白术须根采自北京同仁堂(亳州)饮片有限公司白术标准化种植基地，经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的须根。见表1。

2 方法

2.1 色谱条件 Agela Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)(70% A∶30% B)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；白术内酯Ⅰ、Ⅲ检测波长：220 nm，白术内酯Ⅱ检测波长：276 nm；进样容积：20 μL。对照品和样品色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备 精密称取白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对照品适量，用色谱甲醇配制成浓度分别为140、140、164 μg/mL的白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合对照品储备液，备用。

2.3 供试品溶液制备 取白术须根粉末(过3号筛)1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声(功率250 W，频率60 kHz)40 min，放冷，定容，摇匀，过滤，取续滤液，过针筒状微孔滤头(0.22 μmol/L)，得供试品试液。

2.4 线性关系考察 取白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合对照品储备液5 mL作为母液，并将母液配制成白术内酯Ⅰ、Ⅱ浓度为70、35、17.5、8.75、4.375、2.187 5 μg/mL和白术内酯Ⅲ浓度为82、41、20.5、10.25、5.125、2.562 5 μg/mL的混合对照品溶液。取上述白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进样检测，进样20 μL，每个浓度进样2次，取平均值。以峰面积积分值(A)为纵坐标，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浓度(ρ)为横坐标，分别绘制标准曲线，并计算线性方程，见表2。

表1 白术须根样品信息表

注:1.白术内酯Ⅲ;2.白术内酯Ⅰ;3.白术内酯Ⅱ图1 白术须根样品(A、B)、对照品(C、D)的HPLC色谱图

表2 线性关系考察

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μL，分别连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面积，实验结果显示各对照品中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分别为0.47%、0.15%、0.68%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、20、24 h进样，进样量20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面积，实验结果显示各样品中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分别为2.22%、0.94%、1.37%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批次的白术须根粉末6份，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，进样量20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，实验结果显示各样品中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ平均含量分别为0.0348%、0.0485%、0.0843%，RSD分别为0.95%、1.17%、0.37%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称定样品(X1)白术须根粉末6份，每份0.5 g，分别精密加入等量白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，结果见表3。

表3 白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ加样回收率实验

2.9 含量测定 白术须根供试品溶液按“2.4”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，含量计算以干燥品计，见表4。

3 讨论

本实验首次采用HPLC法同时测定白术须根中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，为白术须根的资源利用开发和质量控制提供参考。本实验研究方法简单、准确、重复性好，可以快速测定白术须根中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，为白术须根的资源再利用和质量评价提供了实验依据。

依据传统用药习惯，白术须根作为非药用部位需去除，但前期实验发现白术须根中含有丰富的挥发油，白术挥发油中60%左右的成分是苍术酮[8]，而苍术酮是白术的主要燥性成分[9]，因此推测白术须根应具有与白术药材类似的功效，如燥湿利水、止汗。因此本研究以白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量测定为基础，为探究白术须根的药效物质基础提供实验依据，同时初步讨论了白术须根再利用的可能性，对节约中药材资源具有一定的意义。

表4 白术须根中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量测定结果