吡非尼酮对糖尿病肾病小鼠肾纤维化的改善作用及机制研究

周芳

(辽宁中医药大学附属医院药学管理部，辽宁 沈阳 110032)

糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症之一，其病理特征主要为肾小球硬化、肾小管间质纤维化等，肾纤维化是指肾内细胞纤维化、硬化，进而造成肾实质硬化，形成瘢痕的过程[1]。目前临床上仅以控制血糖、血压，应用糖皮质激素、免疫抑制剂等来减缓糖尿病肾病的发展，尚无明确、有效的治疗肾纤维化的药物或手段，因此，寻找有效的治疗肾纤维化的方法非常重要。吡非尼酮是一种细胞因子抑制剂，具有防止瘢痕形成的作用，其常用于治疗神经纤维瘤、子宫平滑肌瘤等疾病，且疗效显著[2]。但关于吡非尼酮应用于糖尿病肾病的研究尚少。本实验旨在探讨吡非尼酮对糖尿病肾病小鼠肾纤维化的改善作用及相关机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级，ICR雄性小鼠，6～8周龄，体质量20～22 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。

1.2实验药品试剂及仪器 吡非尼酮胶囊(北京康蒂尼药业有限公司，国药准字H20133376，规格：100 mg)；1%羧甲基纤维素钠溶液(美国Sigma公司)；链尿佐菌素(美国Sigma公司)；尿蛋白定量测试盒(上海雅吉生物科技有限公司)；Masson染色液(武汉博士德生物工程有限公司)；小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体、转化生长因子-β(TGF-β)抗体(英国Abcam公司)，Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)抗体(美国Gene Tex公司)等。Couvter型高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；HM525冷冻切片机(德国MICROM公司)；STM6-LM型光学显微镜(日本Olympus公司)；BDNM-9602G自动酶标仪(美国Biotek公司)等。

1.3方法 将30只小鼠随机分为对照组、模型组、实验组，各10只。三组均正常进食、进水。模型组与实验组小鼠给予链尿佐菌素腹腔注射，以80 mg/kg一次性干预，建立糖尿病肾病模型。造模成功后，将250 mg吡非尼酮溶于1%羧甲基纤维素钠溶液，给予实验组小鼠灌胃，1次/d；正常组与模型组小鼠给予1%羧甲基纤维素钠溶液灌胃给药，1次/d；均连续灌胃7 d。

1.4观察指标 比较三组小鼠肾功能水平，分别收集三组小鼠处死前24 h尿液，使用尿蛋白定量测试盒检测所有小鼠24 h尿蛋白含量；分别采集三组小鼠眼球血100 μL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平。比较三组小鼠肾组织Masson染色情况，采血后，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖收集肾组织，取肾组织于10%中性甲醛固定，依次经脱水、包埋、脱蜡等制备病理切片，切成2 μm切片，行常规Masson染色，透明、封片，于光学显微镜下观察各组小鼠肾组织病理学变化。比较三组小鼠肾组织TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平，取液氮中保存的肾组织，提取总蛋白并测定蛋白浓度，以50 μg蛋白/泳道上样，经常规电泳并电转，以5%牛血清白蛋白进行封闭2 h，一抗(1：500)4℃孵育过夜，二抗(1：5 000)37℃孵育1 h，显色。采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测量各蛋白条带光密度(A)值，目的蛋白的相对表达水平为该蛋白条带与内参GAPDH的比值。

2 结 果

2.1肾功能水平 与对照组比，模型组小鼠24 h尿蛋白含量、BUN、SCr水平均升高，且实验组显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 三组小鼠肾功能水平比较

2.2肾脏组织Masson染色情况 对照组小鼠肾小管间质无明显纤维化，未见增生及炎性细胞浸润等；模型组小鼠肾小管间质有明显增生、纤维化，并伴有大量炎性细胞浸润等；实验组小鼠肾小管间质有轻微纤维化，且仅有少量炎性细胞浸润等。见图1。

注：A.对照组；B.模型组；C.实验组。图1 光学显微镜下观察海马组织Masson染色(×100)

2.3TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平 与对照组相比，模型组小鼠肾组织TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平均升高，且实验组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A.对照组；B.模型组；C.实验组。图2 蛋白免疫印迹法检测小鼠肾组织α-SMA、TGF-β、Col Ⅰ蛋白表达

3 讨 论

链尿佐菌素是一种氨基葡萄糖—亚硝基脲，其属于广谱抗菌素的一种，具有良好的抗肿瘤及抗菌的作用[3]，但其可通过葡萄糖转运蛋白而进入细胞内，对β细胞的毒性进行诱导释放，且对阳性神经内分泌肿瘤细胞具有毒性作用，进而升高机体血糖水平，且可对肾脏造成损伤[4]。本实验以链尿佐菌素对小鼠进行灌胃干预，成功建立糖尿病肾病小鼠模型[5]。

肾纤维化的病理特征为纤维结缔组织增生、肾实质细胞减少、细胞外基质沉积等，若未采取及时有效的治疗，其可进一步发展为肾衰竭，进而对患者的生命健康造成严重影响[6-7]。激素类药物是目前临床治疗机体器官纤维化常用方法，但长期使用激素治疗可出现库欣综合征、水肿、低血钾等不良反应，影响其疗效[8]。吡非尼酮是一种吡啶酮类化合物，具有广谱的抗纤维化作用，对上皮—间质的转化具有诱导作用，促进成纤维细胞的增殖与转化，且对细胞外基质沉积起促进作用，且可诱导其他纤维化因子表达[9]。本研究结果显示，实验组小鼠24 h尿蛋白含量、BUN、SCr水平均低于模型组，且实验组小鼠肾小管间质纤维化及炎性细胞浸润程度均优于对照组，提示吡非尼酮可改善糖尿病肾病小鼠的肾功能，并可改善肾纤维化，与权晓娟等[10]研究结果基本相符。TGF-β是一种中枢因子，具有放大炎症的作用，且其水平升高可刺激成纤维细胞的生长和发育，进而促进肾纤维化的发展；α-SMA可反映肾间质纤维化的进展，其表达水平与肾纤维化程度密切相关；Col Ⅰ在机体受到高糖刺激后，由肾小球系膜细胞大量释放，其表达可直接反映肾纤维化的程度[11]。吡非尼酮可清除活性氧，减少细胞外基质的合成，进而减轻肾损伤，控制肾纤维化进展。本研究结果显示，实验组小鼠肾组织TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平相较于模型组均降低，提示吡非尼酮可减少糖尿病肾病小鼠肾组织TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表达水平，从而控制肾纤维化的发展进程，与徐建华等[12]研究结果基本一致。

综上所述，吡非尼酮可改善糖尿病肾病小鼠肾功能及肾纤维化，同时减少小鼠肾组织TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表达水平，从而控制肾纤维化的发展进程，可为临床治疗糖尿病肾病提供新的思路，但本实验样本量较少，值得大样本量进一步研究。