产Reuterin罗伊氏乳杆菌的定向筛选及其生物学特性

李一娟，邵开生，张 娜，孟迎平，陶雪莹，周颖钰，魏 华,2，张志鸿,2,

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌 330047）

随着抗生素的滥用，超级细菌及环境污染问题日益严重，迫切需要开发有效、绿色无污染的抗生素替代品。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）作为一种广泛存在于脊椎动物肠道的共生微生物，是肠道微生态系统中的优势菌群，长期作为益生菌使用，在预防腹泻[1]、改善胆固醇代谢[2]、缓解抑郁症[3]及降低婴幼儿哭闹[4]等方面具有重要功能。Reuterin是罗伊氏乳杆菌代谢甘油产生的一种特有广谱抗菌物质，它是一种复杂混合物，主成分为3-羟基丙醛，对多种病原微生物均有较强的抑制作用，在生物防腐方面极具潜力[5]。

动物宿主中分离的罗伊氏乳杆菌在进化过程中会形成菌株适应性，依据多位点序列分析，可分为6 种家系，分别对应不同动物类型[6]，其中第6种家系的菌株主要来自家禽或人体，携带pdu基因簇概率高。该基因簇的一个重要作用是编码产生具有抗菌作用的Reuterin，而第6种家系的菌株利用甘油代谢产Reuterin的量高于其他家系[7]。目前，国内外多数研究报道从鸡、猪、鼠、婴儿和成人的粪便中分离到罗伊氏乳杆菌，而从健康家禽粪便中筛选产Reuterin的罗伊氏乳杆菌的报道相对较少。为此，本研究利用选择培性养基从健康家禽粪便中定向筛选产Reuterin的罗伊氏乳杆菌，并评价其生物学活性，以期为益生菌的开发和利用提供候选菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜家禽（鸡、鸭和鸽）粪便样品取自当地农贸市场，数量分别为4、2、2 份；大肠埃希氏杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311、单核细胞性李斯特菌CMCC54007、金黄色葡萄球菌CMCC26003为实验室保藏的菌株。

MRS培养基 英国Oxoid公司；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培养基 北京索莱宝生物科技有限公司；抗生素（用于试纸扩散法） 浙江省温州市康泰生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50A型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物仪器有限公司；Anaerobic IV型多功能厌氧培养箱 美国GeneScience公司；H1650-W型台式离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYY-6C凝胶水平电泳仪北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 培养基及试剂的配制

罗伊氏乳杆菌选择性培养基（L.reuteriisolation medium，LRIM）：称取15.0 g棉子糖、15.0 g乙酸钠、10.0 g蛋白胨、6.0 g磷酸二氢钾、5.0 g酵母提取物、2.0 g醋酸铵、1.32 mL冰醋酸、1.0 g吐温80、0.57 g硫酸镁、0.12 g硫酸锰、0.003 g硫酸亚铁，加蒸馏水定容至1 000 mL，固体培养基需加入15 g琼脂，121 ℃高压灭菌15 min[8]；模拟胃液：3.0 g/L胃蛋白酶，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶解，pH值调至3.0；模拟十二指肠液：10.0 g/L牛胆盐，PBS溶解，pH值调至8.0；模拟肠液：1.0 g/L胰蛋白酶，3.0 g/L牛胆盐，PBS溶解，pH值调至8.0，分别过滤除菌，4 ℃保存备用[9-10]。

1.3.2 乳酸菌分离

称取新鲜家禽粪便1 g，加入9 mL无菌PBS，振荡充分混匀后，依次进行10 倍梯度稀释，分别取100 μL的10－3～10－5梯度稀释液涂布于LRIM平板上，将平板倒置于厌氧培养箱中45 ℃培养48 h[8]，显微镜观察并记录形态[11]。

1.3.3 16 S rDNA同源性分析

选取形态为杆状的单菌落进行后续菌落聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），利用16S rRNA通用引物27F和1492R（表1）进行基因片段扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测定核酸序列，将测定结果中的碱基序列输入NCBI数据库进行比对，初步确定菌株种属，进一步与数据库中菌属比对并构建系统发育树，确定其具体种属。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.3.4 罗伊氏乳杆菌编码Reuterin基因的筛查

Reuterin是罗伊氏乳杆菌pdu基因簇编码产生的，利用pduC特异性引物（表1）构建PCR特异性识别体系，10 μL 2×TaqPCR Master Mix，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，双蒸水补充至总体积为20 μL，石蜡油液封。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 次循环；72 ℃终延伸10 min，扩增产物长度为121 bp。其中，罗伊氏乳杆菌的基因组DNA的提取方法为热裂解法[12]，提取后－20 ℃保存备用。

1.3.5 罗伊氏乳杆菌甘油发酵产Reuterin

Reuterin的产生方法参照文献[15]。将活化好的罗伊氏乳杆菌以1%的量接种于MRS培养液中，37 ℃厌氧培养24 h，4 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤菌体一次，用250 mmol/L甘油重悬菌体（～109CFU/mL），37 ℃孵育2 h，12 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，4 ℃保存，备用。

1.3.6 Reuterin的定量

采用比色法定量Reuterin[15]，取100 μL上述滤液，加入75 μL色氨酸溶液（0.01 mol/L色氨酸溶于0.05 mol/L HCl溶液中），接着加入300 μL浓HCl，37 ℃条件下孵育30 min后呈紫色，于560 nm波长处测定OD值，蒸馏水代替滤液作为阴性对照。以0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL的丙烯醛溶液代替滤液进行上述反应，以质量浓度为横坐标，OD560nm为纵坐标绘制标准曲线，用于定量Reuterin。

1.3.7 罗伊氏乳杆菌的耐受性

1.3.7.1 耐酸耐胆盐能力

将罗伊氏乳杆菌发酵液于4 000 r/min、4 ℃条件下离心3 min，弃上清液，PBS洗涤菌体2 次，以1%的量接种于pH值分别为2.5、3.5的MRS培养液中，37 ℃厌氧培养，分别于0、3、6 h取样并进行活菌计数。同样将罗伊氏乳杆菌接种于牛胆盐质量浓度为1.5 g/L的MRS培养液中，分别于0、3、6 h取样后进行活菌计数。

1.3.7.2 耐受模拟消化道环境能力

参考Nikolic等[16]的方法，并稍加改进。取罗伊氏乳杆菌发酵液于8 000 r/min、4 ℃离心4 min，PBS洗涤菌体2 次，重悬于1.9 mL模拟胃液和0.1 mL 10%脱脂乳中，37 ℃有氧培养90 min后（胃与呼吸道相连，有部分氧气存在），取100 μL菌液进行活菌计数；离心后，用1.9 mL模拟十二指肠液重悬菌体，厌氧培养10 min后，取100 μL菌液进行活菌计数；离心后，用1.8 mL模拟肠液重悬菌体，厌氧条件下培养2 h后，取100 μL菌液进行活菌计数。

1.3.7.3 耐受过氧化氢能力

参照Shi Yunjia等[17]的方法，将罗伊氏乳杆菌发酵液于4 000 r/min、4 ℃条件下离心3 min，弃上清液，PBS洗涤菌体2 次，以1%的量接种于过氧化氢浓度分别为0.6、1.0 mmol/L的MRS培养液中，分别于0、3、6 h取样，并进行活菌计数。

1.3.8 抗生素敏感性

依照文献报道的试纸扩散法（K-B法）[18]，将罗伊氏乳杆菌发酵液浓度调整至105～106CFU/mL，取100 μL均匀涂布于MRS平板上，待平板表面稍干，将抗生素药敏纸片均匀放置于表面，轻轻按压使纸片贴合，37 ℃厌氧培养24 h后，测量透明圈直径。

1.3.9 甘油发酵上清液的抑菌能力

利用牛津杯法评估罗伊氏乳杆菌发酵甘油后的抑菌活性[19]。将罗伊氏乳杆菌接种于含250 mmol/L甘油的MRS培养基中，37 ℃培养，取过夜培养的指示菌悬液200 μL，浓度约为107CFU/mL，均匀涂布于LB固体平板上，室温晾干后，均匀放置3 个牛津杯（直径为（7.8±0.1）mm），轻轻加入200 μL罗伊氏乳杆菌发酵液上清液，将平板移至恒温培养箱，37 ℃培养12 h后，测量抑菌圈大小。非甘油发酵的上清液为对照组，即罗伊氏乳杆菌在不加甘油的MRS培养液中培养后的上清液。

1.3.10 罗伊氏乳杆菌黏附能力

将贴壁HT-29细胞转移至含10%胎牛血清和双抗（100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）的DMEM细胞培养液中，于37 ℃、5% CO2条件下培养至细胞形态和生长状态良好。根据文献报道方法[20]，评价罗伊氏乳杆菌的黏附能力，首先调整细胞浓度至2.5×105个/孔（6 孔板），待细胞形成单细胞层，用HANK’S清洗细胞2 次，每孔加2 mL用不含双抗的DMEM培养液调整的罗伊氏乳杆菌悬液（～108CFU/mL），孵育2 h，弃培养液，HANK’S冲洗2 次，胰蛋白酶进行消化，接着用MRS培养液冲洗细胞至脱落，梯度稀释后进行菌落计数。黏附率以黏附于细胞上的罗伊氏乳杆菌数对数与初始细菌总数对数之比表示。

1.4 数据处理

实验均重复3 次，采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析，各组总体均数采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）进行显著性比较（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 分离株的鉴定及其产Reuterin能力

对采用选择性培养基分离得到的潜在乳杆菌进行16S rDNA同源性分析，并经NCBI数据库比对，初步鉴定其中4 株菌为罗伊氏乳杆菌，进一步与NCBI数据库中已知序列的罗伊氏乳杆菌构建系统发育树，结果如图1所示，4 株菌均与已知菌株的序列同源性在99%以上，均可确定为目标罗伊氏乳杆菌，命名为WLRE01、WLRE02、WLRE03、WLRE04（分别来自于鸭、鸭、鸽、鸽的粪便）。针对编码Reuterin的pduC基因构建特异性PCR，验证4 株罗伊氏乳杆菌是否携带pduC基因，结果如图2所示，WLRE01、WLRE03和WLRE04均携带pduC基因，而WLRE02（泳道4）和阴性对照（泳道C）均无特异性条带，说明不携带pduC基因。对筛选到的4 株罗伊氏乳杆菌进行甘油发酵，只有3 株携带pduC基因的菌株发酵甘油后产Reuterin，且WLRE04产量最高，达（9.722±0.168）mg/mL（表2）。这与文献报道的家禽源罗伊氏乳杆菌绝大部分携带pdu基因簇并能代谢甘油产具有抗菌活性物质Reuterin的结果一致[21]，这也证实本研究定向筛选产Reuterin的罗伊氏乳杆菌的方法有效。

图1 基于16S rDNA基因序列构建罗伊氏乳杆菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of L.reuteri based on 16S rDNA gene sequences

图2 验证pduC基因的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplified pduC gene

表2 罗伊氏乳杆菌发酵甘油产Reuterin能力Table 2 Ability of L.reuteri to produce reuterin from glycerol

2.2 耐酸耐胆盐能力

益生乳酸菌具有较强耐受酸和胆盐能力是进入肠道并发挥益生功能的前提。由图3A可知，在pH 2.5条件下处理3 h后，3 株菌均维持在106～107CFU/mL，而WLRE04活菌数与对照组相比显著降低（P＜0.05）；处理6 h后，3 株菌活菌数相比对照组均显著降低（P＜0.05），其中WLRE04活菌数下降最明显，达1 个数量级（P＜0.000 1），这与贾丹等[22]报道的罗伊氏乳杆菌ZL2a的结果一致。在pH 3.5条件下（图3B）处理3 h或6 h后，3 株菌活菌数变化较少，均维持在106～107CFU/mL，只有WLRE01在6 h后的活菌数相比对照组显著下降（P＜0.05）。由图3C可知，在胆盐质量浓度为1.5 g/L的环境条件下，3 株菌活菌数随孵育时间延长呈逐渐下降的趋势，处理3 h后，WLRE03活菌数基本维持初始水平，WLRE01、WLRE04活菌数均显著下降（P＜0.000 1）；处理6 h后，WLRE01、WLRE04活菌数继续下降至106CFU/mL。

图3 罗伊氏乳杆菌在pH 2.5（A）、pH 3.5（B）和1.5 g/L胆盐（C）环境中的耐受性Fig.3 Tolerance of L.reuteri to pH 2.5 (A), pH 3.5 (B) and 1.5 g/L bile salt (C)

由于正常人的胃液pH值在2～3之间波动，而胆盐质量浓度在0.3 g/100 mL左右，因此，定向筛选的菌株具有良好的耐酸耐胆盐能力，菌株在pH 2.5或1.5 g/L胆盐质量浓度条件下孵育6 h仍维持较高质量浓度，为其在肠道进一步发挥益生作用提供了保证。

2.3 耐过氧化氢能力

过氧化氢是一种强氧化剂，长时间作用于细胞和组织，可造成机体氧化损伤[23]。因此，对过氧化氢的耐受性是评价菌株抗氧化能力的重要指标。从图4A可以看出，3 株菌在含0.6 mmol/L过氧化氢的MRS培养基中状态良好，甚至有活菌数升高的趋势，尤其是WLRE03、WLRE04在处理6 h后活菌数与对照组相比显著升高（P＜0.000 1）；当过氧化氢浓度为1 mmol/L时，处理3 h后，只有WLRE01活菌数显著下降（P＜0.000 1）；而处理6 h后，3 株菌活菌数相比对照组均显著下降（P＜0.000 1），其中WLRE01活菌数下降约2 个数量级，而WLRE03、WLRE04活菌数下降不足1 个数量级（图4B）。由此说明，3 株菌均有比较好的抗氧化能力，而WLRE03和WLRE04表现最佳。

图4 罗伊氏乳杆菌对0.6 mmol/L（A）和1 mmol/L（B）过氧化氢的耐受力Fig.4 Tolerance of L.reuteri to 0.6 mmol/L (A) and 1 mmol/L (B)hydrogen peroxide

2.4 模拟胃肠液耐受力

乳酸菌在经胃、肠消化过程中，除了胃酸和胆盐，各种消化酶也会影响菌体最终到达肠道的活菌数[24]。图5结果表明，WLRE03模拟十二指肠液消化后，与对照组相比活菌数有明显下降（P＜0.01），在模拟肠液中消化2 h后，活菌数虽有明显下降，但仍保持了较高的水平（2.11×108CFU/mL）；WLRE01、WLRE04经过模拟胃液和十二指肠液消化后，活菌数基本保持不变，经过模拟肠液消化2 h后，与对照组相比，活菌数均显著下降（P＜0.001，P＜0.000 1），但不足1 个数量级，这与张如春等[25]报道罗伊氏乳杆菌JF036的结果一致，其经模拟胃肠液处理后，活菌数仍高于1.0×108CFU/mL。该结果说明，本研究3 株菌对模拟胃肠液均具有良好的耐受性。相比于单纯的酸环境，菌株在模拟胃液中的活菌数水平更高，这可能与胃蛋白酶削弱了酸对菌体的胁迫有关[26]。模拟肠液对3 株菌的活力均产生负面影响，这可能是受到胆盐作用的影响。

图5 罗伊氏乳杆菌在模拟胃肠液中的存活情况Fig.5 Survival of L.reuteri in simulated gastrointestinal juice

2.5 抗生素敏感性

乳酸菌抗生素敏感性测试是评估菌株安全性的一项重要指标，由表3可知，筛选的罗伊氏乳杆菌对不同种类的抗生素表现出不同的敏感程度。它们对庆大霉素、氯霉素和利福平均比较敏感，对环丙沙星、红霉素、四环素和卡那霉素具有抗性。特别地，不同来源的罗伊氏乳杆菌常表现出不同的抗生素敏感性，如贾丹等[22]报道猪源罗伊氏乳杆菌ZL2a对氯霉素不敏感以及朱振军等[27]发现老人源的罗伊氏乳杆菌对红霉素和四环素敏感，对氯霉素具有抗性，这与本研究结果相反；张如春等[25]发现狐源罗伊氏乳杆菌对氯霉素敏感，对环丙沙星不敏感，这与本研究结果具有一致性，这种差异性可能是由于质粒携带的抗性基因不同决定的。

表3 罗伊氏乳杆菌对不同抗生素的敏感性Table 3 Sensitivity of L.reuteri to different antibiotics

2.6 甘油发酵上清液的抑菌能力评估

在已有结果证实定向筛选的罗伊氏乳杆菌能发酵甘油产Reuterin的基础上，进一步证明甘油发酵上清液对常见食源致病菌的抑制作用，为其在肠道健康方面的应用开发提供基础数据。如表4所示，甘油发酵液上清液对金黄色葡萄球菌表现出较高的抑制能力，这与池海波等[28]的研究结果一致。与非甘油发酵相比，WLRE01、WLRE03和WLRE04的抑菌圈直径分别增大了14、20、17 mm，说明金黄色葡萄球菌对Reuterin非常敏感；单核细胞性李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌也表现出较强的Reuterin敏感性；特别的是，甘油发酵上清液对大肠杆菌无明显的抑菌能力，推测该菌可能含有相关抗性基因。李文静[29]和朱振军[27]等报道了罗伊氏乳杆菌发酵上清液中酸性物质具有一定的抑菌作用，但其对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的抑制效果均不及本研究Reuterin的效果；池海波等[28]研究结果表明了罗伊氏乳杆菌发酵甘油上清液的抑菌性能较一次发酵液（MRS培养液中生长）有明显提高。罗伊氏乳杆菌产生具有抗菌特性的Reuterin将为其在自然环境、宿主体内竞争提供保证，对提高菌株的适应性具有重要意义[21]。

表4 罗伊氏乳杆菌甘油发酵上清液对食源性致病菌的抑菌圈直径Table 4 Inhibition of reuterin produced by L.reuteri on foodborne pathogens mm

综上结果，本研究筛选的罗伊氏乳杆菌可产Reuterin，并具有较强的抑制病原微生物的能力，为进一步挖掘其在预防肠道感染方面的功效奠定基础。

2.7 黏附肠上皮细胞的能力

肠上皮细胞黏附能力是评价乳酸菌益生功能的一项重要指标，也是其定植于肠道发挥益生功能的前提条件。本研究定向筛选的罗伊氏乳杆菌均具有良好的肠上皮细胞黏附能力，黏附率在72%以上（图6）。其中WLRE01黏附率高达81%，这与张紫薇等[30]研究报道的罗伊氏乳杆菌J1的黏附性能相似，其黏附率为87.93%。由于其来源于家禽肠道，其是否能在其他宿主肠道黏附定植并长期发挥其益生功能有待进一步探究。

图6 罗伊氏乳杆菌对HT-29细胞的黏附力Fig.6 Adhesion capacity of L.reuteri to HT-29 cells

3 结 论

本研究采用选择性培养基从健康家禽新鲜粪便定向筛选到4 株罗伊氏乳杆菌，经生理生化及分子生物学技术证明其是需要的目标菌株，命名为WLRE01、WLRE02、WLRE03、WLRE04。通过菌株发酵代谢实验说明其中WLRE01、WLRE03、WLRE04能产抗菌物质Reuterin，且WLRE04的产量高达（9.722±0.168）mg/mL，其甘油发酵上清液对一些食源致病菌具有很强的抑制能力，而对金黄色葡萄球菌的抑制圈直径达（28.1±1.2）mm；它们能在pH 2.5、pH 3.5和1.5 g/L胆盐条件下维持较高活菌数达6 h，且能受模拟胃肠液消化而保持稳定的细胞浓度；同时，它们还表现出良好的抗氧化活性以及肠上皮细胞黏附能力。由此，可推测这些菌株均可以顺利通过胃肠道的极端环境条件，并黏附定植于胃肠道。它们可作为肠道益生菌候选菌株，供进一步研究。