苏德森,郑云云,陈自强,吴建衍,黄崇耀
(福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,福建省农产品质量安全重点实验室,福建 福州 350003)
金柑,别名金橘,皮嫩脆,具有油脂清香刺激性特殊气味,富含VC、胡萝卜素,深受人们喜爱[1-3]。适当摄取金柑,对防治咽喉肿痛、咳痰、胸闷腹胀等身体不适症状具有良好的效果[4-5]。然而,由于金柑皮薄、水分高,因此不易保存。最常用、最经济的保鲜方式需要使用化学试剂[6-8]。
咪鲜胺又称扑霉灵、丙灭菌、施保克,是咪唑类广谱农药杀菌剂,其抑制麦角甾醇的生物合成,对多种作物子囊菌和半知菌病害的防效显著,其可防治稻瘟病、叶斑病、赤霉病、炭疽病、褐斑病、蒂腐病、青绿霉病、黑腐病等病害[9-10]。同时,咪鲜胺是柑橘采后保鲜的浸果药剂[11-12]。咪鲜胺在水果中缓慢降解,最终代谢产物为2,4,6-三氯苯酚[13-15]。2,4,6-三氯苯酚在脂质组织中累积会影响人的神精系统和呼吸系统的正常运转,严重时会患白血病和淋巴瘤等疾病[16-17]。2,4,6-三氯苯酚易造成环境污染[18],美国环保署已经把三氯苯酚列入环境污染物清单中[19]。
苹果[20]、香蕉[21]、温州蜜柑果实[22]、柑橘果实[23]、杨梅和杨梅酒[24]等水果及其加工产品在贮藏过程中的咪鲜胺残留降解已有报道。金柑为可食皮类水果,与只可吃果肉的水果相比,金柑对人体的暴露风险更高,更应引起关注。然而,浸果保鲜处理后,咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚在金柑中的残留随贮藏时间消解变化及风险评估的研究鲜见报道。
本实验中的金柑经3 种质量浓度咪鲜胺溶液、2 种浸泡时间进行保鲜处理。实验建立气相色谱-串联质谱(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)同时测定金柑中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚含量的方法,并采用该方法分别测定室温贮藏2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d金柑样品中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的含量,分析不同浸泡质量浓度和浸泡时间的处理对金柑中咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚残留量的影响及其随时间变化的动态特征,并评估浸果安全期后金柑中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的慢性和急性膳食风险。
金柑于2019年1月22—23日采摘自福建省尤溪县管前镇。
乙酸乙酯、丙酮、正己烷(均为色谱纯),氯化钠、硫酸镁、PSA、碳黑(均为分析纯) 天津市科密欧化学试剂发展有限公司;咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚标准物质(纯度均大于98%) 北京振翔有限公司;咪鲜胺水乳剂(质量浓度为450 g/L) 江苏辉丰农化股份有限公司。
GCMS-TQ8050气相色谱-三重四极杆质谱仪、Rxi-5Sil MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 日本岛津公司;MS3 basic高速涡旋振荡仪 德国IKA公司;FW100粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;AL204天平瑞士梅特勒-托利多公司;Anke TDL-5A离心机 上海安亭科学仪器厂;turboVap LV全自动样品浓缩仪 瑞典Biotage有限公司;PD500-TP均质机 英国PRIMA公司。
1.3.1 浸果保鲜处理
挑选完整无缺陷、无虫咬、无破损的金柑42.0 kg(约1 680 枚)作为备用样品,每次浸果用样品3.5 kg(约140 枚)。咪鲜胺浸泡液配制方法:将质量浓度450 g/L的咪鲜胺水乳剂用自来水分别稀释至1 000、500、167 倍,其质量浓度为450、900、2 700 mg/L。将金柑样品完全浸入咪鲜胺浸泡液中,每个质量浓度分别取浸泡2、5 min的样品;对照样品直接用自来水浸泡。每处理3 次重复(每种质量浓度浸泡液平均分成3 份,每份浸泡液单独浸泡金柑,即获得3 份重复实验样品),样品捞起自然晾干后,置于室内20~25 ℃贮藏。
1.3.2 样品制备
保鲜取样方法按实验设计要求,分别取浸泡后室温贮藏2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的样品。金柑样品去除柄,取全果,用粉碎机磨碎,样品-20 ℃冷冻贮存。
1.3.3 样品提取与净化
称取样品10 g,精确至0.01 g于50 mL离心管中。加入20 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶1,V/V),加1 g NaCl均质处理0.5 min,加4 g MgSO4,再均质处理0.5 min,于室温、4 000 r/min离心3 min。移取上清液8 mL于10 mL离心管,氮气吹至约1 mL。加入150 mg PSA、100 mg碳黑,旋涡振荡1 min至溶液无色,用乙酸乙酯正己烷溶液定容至2 mL。取上清液1.0 mL,过0.22 µm有机滤膜,进行GC-MS/MS上机测试。
1.3.4 仪器条件
气相色谱条件:程序升温,于50 ℃保持1 min,以40 ℃/min的速率升至200 ℃,再以15 ℃/min的速率升至250 ℃并保持3 min;进样口温度250 ℃,不分流进样,恒压流量控制120 kPa。
质谱条件:电子电离源,电离能量:70 eV,离子源温度:200 ℃,接口温度:250 ℃。
表1 咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol
GC-MS/MS测定数据由GCMSsolution 4.3软件处理。农药慢性、急性膳食风险按式(1)、(2)计算。
式中:HQc为慢性摄入风险;STMR为农药残留值;F为产品消费量,柑橘类水果为0.025 8 kg/d[25];m为人群平均体质量,成年人为60 kg;ADI为每日允许摄入量,咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚总和,以咪鲜胺计为0.01 mg/kg[26]。HQa为急性摄入风险;LP为食品的最大消费量,柑橘为1.8678 kg/d[25];HR为最高残留量;ARfD为急性参考剂量,0.1 mg/kg[27]。HQc小于等于100.0%或HQa小于等于100.0%表示可接受的风险,HQc大于100%或HQa大于100.0%表示风险不可接受。
通过样品加标逐级稀释的方法信噪比为3时,确定检出限(limit of detection,LOD),信噪比为10时确定定量限(limit of quantitation,LOQ)。当本实验中咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚的LOD分别为1.70、0.68 µg/kg,LOQ分别为5.0、2.0 µg/kg。水果蔬菜中咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚的测定方法已有报道,其中采用气相色谱仪测定咪鲜胺衍生物的LOD为5 µg/kg[28],GC-MS/MS法直接测定咪鲜胺的LOD为辣椒3.3 µg/kg、水果4 µg/kg,2,4,6-三氯苯酚的LOD为辣椒3.3 µg/kg、水果5 µg/kg[29-30]。本实验的LOD能满足金柑中咪鲜胺及低含量2,4,6-三氯苯酚的测定。
以标准溶液的质量浓度为横坐标,定量离子对峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。咪鲜胺Y=3 763.645X-69 594.76,R2=0.996 7;2,4,6-三氯苯酚Y=13 535.01X-12 515.16,R2=0.999 2。方法线性相关系数R2大于0.996 7。
准确度和精密度通过向未检出咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚的金柑样品中添加标准溶液评估。咪鲜胺添加50、100、500 µg/kg共3 个水平,2,4,6-三氯苯酚添加20、50、150 µg/kg共3 个水平,每个浓度水平测定7 次,测定回收率。
咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚的平均加标回收率分别为95.7%、98.1%,平均相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为5.14%、3.89%。加标量的回收率和精密度能满足本研究要求。
表2 金柑中咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚的加标回收率及精密度Table 2 Recoveries and precision for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol in spiked kumquats
实验分别比较450、900、2 700 mg/L共3 种浸泡质量浓度,于2、5 min浸泡时间的金柑中测定咪鲜胺的残留消解动态,结果如图1所示,3 种质量浓度浸果处理金柑中咪鲜胺的残留量较高。在贮藏21 d内,咪鲜胺的残留量均大于等于7.44 mg/kg,2 700 mg/L的高质量浓度浸果处理的残留量更高,均大于10 mg/kg,其超出GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》对柑橘类水果的最大残留限量值[26]。浸泡浓度越高、浸泡时间越长,金柑中的咪鲜胺残留量也越高。所以,在保证保鲜效果的前提下,应降低浸泡浓度和减少浸泡时间。
图1 咪鲜胺浸泡质量浓度和时间对金柑中咪鲜胺残留的动态影响(n=3)Fig.1 Residual dynamics of prochloraz in kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time (n = 3)
在20~25 ℃室温贮藏,金柑中的咪鲜胺含量先升高后降低,第3天达到峰值,450、900、2 700 mg/L咪鲜胺浸泡2 min的金柑中咪鲜胺含量分别达到9.66、12.22、15.43 mg/kg。第3天后,咪鲜胺残留量降低缓慢。按照农药登记推荐使用方法(450 mg/L浸果2 min)处理金柑,在农药登记第14天的安全间隔期时,金柑中咪鲜胺的残留量为8.18 mg/kg,小于最大残留限量值10 mg/kg。若高于推荐质量浓度的900、2 700 mg/L分别浸果2 min处理,第14天金柑中咪鲜胺残留量均高于最大残留限量值。说明金柑咪鲜胺浸果处理应严格控制浸泡液浓度,按照推荐浓度或低于推荐浓度浸果处理,金柑的生产质量安全才能符合标准。
如图2所示,咪鲜胺浸泡的质量浓度和时间均是影响金柑中2,4,6-三氯苯酚残留的因素。按照咪鲜胺农药登记使用说明方法(450 mg/L浸泡2 min)处理,浸泡后2 h,金柑中2,4,6-三氯苯酚的残留量为0.028 mg/kg,结果与Fang Qingkui等[20]以相同浓度处理的苹果中2,4,6-三氯苯酚残留水平相当。浸泡质量浓度越高、时间越长,金柑中的2,4,6-三氯苯酚残留量越大,当用质量浓度为2 700 mg/L的咪鲜胺浸泡5 min时,金柑中2,4,6-三氯苯酚残留量达到0.093 mg/kg。此外,2,4,6-三氯苯酚含量与咪鲜胺含量呈正相关,金柑中咪鲜胺含量高,其2,4,6-三氯苯酚的含量也高,因此2,4,6-三氯苯酚是咪鲜胺的分解产物。
图2 咪鲜胺浸泡质量浓度和时间对金柑中2,4,6-三氯苯酚残留的动态影响(n=3)Fig.2 Residual dynamics of 2,4,6-trichlorophenol in kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time (n = 3)
随着贮藏时间的延长,金柑中2,4,6-三氯苯酚残留量逐渐增加,直至21 d,2,4,6-三氯苯酚残留量仍在增加,2 700 mg/L咪鲜胺浸泡5 min的2,4,6-三氯苯酚残留量达0.152 mg/kg,此结果与Fang Qingkui等[20]得出苹果中2,4,6-三氯苯酚浓度随时间延长而增加的结果类似。因为2,4,6-三氯苯酚具有致癌性、结构稳定,在环境中不易降解,其被美国国家环境保护局(United States Environmental Protection Agency,USEPA)列入环境污染物清单中,USEPA在饮用水中标识其风险质量浓度为3.1×10-7µg/L[19]。然而,目前为止,我国尚未对食品中2,4,6-三氯苯酚的最大残留量进行限定。所以,从金柑以及其他水果中2,4,6-三氯苯酚的残留累积效应及其对人体造成的危害方面考虑,应制定水果中2,4,6-三氯苯酚最高限量标准,并高度关注其摄入风险。
咪鲜胺作为采后防腐保鲜剂使用,其在柑橘中的农药登记使用安全间隔期为14 d。本实验对浸泡后贮藏14 d的金柑中咪鲜胺摄入风险进行了评估,结果如表3所示,监管残留试验残留中值(supervised trials median residues,STMR)和最大残留量(highest residue,HR)为咪鲜胺残留量与以咪鲜胺计的2,4,6-三氯苯酚残留量之和,其中2,4,6-三氯苯酚残留量按2,4,6-三氯苯酚与咪鲜胺的分子质量比197.5∶376.8换算成咪鲜胺。表3中,HQc变化范围为35.6%~70.3%,小于100 %;HQa变化范围为296.4%~583.4%,均大于100%;风险评估结果说明用450、900、2 700 mg/L共3 种质量浓度浸泡处理金柑,14 d后咪鲜胺的慢性摄入风险在可接受的范围内,但按每人每日最高摄入金柑1.867 8 kg计算咪鲜胺的急性摄入风险已超出了临界值,风险不可接受。金柑是皮可生食的少数柑橘品种,相对而言,金柑比其他不可食皮的柑橘咪鲜胺急性摄入风险更高。所以,从风险评估结果分析,450 mg/L的咪鲜胺浸果2 min的使用方法不适用于金柑,建议修改其浸果使用方法,如:1)降低浸果浓度;2)减少浸果时间;3)单独针对金柑类柑橘水果,登记咪鲜胺浸果的使用方法。
表3 浸泡不同咪鲜胺质量浓度和时间的金柑与其贮存过程中咪鲜胺的摄入风险Table 3 Risk of dietary exposure to prochloraz from kumquats dipped in prochloraz solutions of different concentrations for different periods of time and its’ storage
本实验建立GC-MS/MS法同时测定金柑中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的方法,该方法有较低的检出限、较宽的线性范围、准确度和精密度,能满足金柑中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的准确定性和定量分析。咪鲜胺浸果处理,金柑中咪鲜胺残留量先升高后缓慢降低,浸泡质量浓度越高、浸泡时间越长,咪鲜胺残留量越大;450 mg/L浸泡2 min,金柑中咪鲜胺残留量在咪鲜胺安全间隔期14 d为8.18 mg/kg,小于柑橘最大残留限量值;更高浸泡质量浓度900、2 700 mg/L,贮藏14 d咪鲜胺残留量均高于最大残留限量值。直到21 d,2,4,6-三氯苯酚含量随贮藏期的延长而不断升高,450 mg/L浸泡2 min贮藏至第21天时,金柑中检出值为0.072 mg/kg。对浸泡后贮藏14 d的金柑中咪鲜胺摄入风险进行评估发现,450、900、2 700 mg/L共3 种质量浓度浸泡处理金柑,14 d后咪鲜胺的慢性摄入风险在可接受范围内,其急性风险不可接受。为降低咪鲜胺的摄入风险,应进一步研究咪鲜胺保鲜金柑的浸果浓度或时间对急性、慢性摄入风险的影响及其规律,以期为保障咪鲜胺贮存、保鲜金柑的安全性研究提供参考。