QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定稻田水产品中氟虫腈及其代谢物残留

马丽莎，谢文平，尹 怡，单 奇，刘书贵，李丽春，赵 成，郑光明

（中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部水产品质量安全风险评估实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380）

近年来，稻渔共作的新型生产方式不仅体现绿色、自然、共生的农业生态理念，同时是我国水产养殖业重点打造的民族品牌，但农业耕作过程中农药的不合理施用可能影响其产品质量安全。氟虫腈是苯基吡唑类新型高活性杀虫剂，其可阻碍昆虫氯化物代谢解毒进程[1]，曾广泛用于水稻等多种经济作物的虫害防治中[2]。但研究表明，氟虫腈对生物神经、消化及循环等系统有毒副作用[3-5]，严重时可引发致畸效应，甚至引发致癌效应[6]，其在环境中可分解成比自身毒性更强的氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈共3 种代谢物[7-8]，其结构式如图1所示。因此欧盟EU 1127/2014[9]及我国GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》[10]规定食品中氟虫腈的残留量以氟虫腈及其3 种代谢物换算分子质量后的总含量计算，即氟虫腈及氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈砜共4 种毒性物质。目前氟虫腈已被欧盟禁止用于人类食品产业链的畜禽养殖过程，我国也限制了氟虫腈的销售和使用[11]，但仍存在氟虫腈超范围使用的问题，欧盟食品和饲料快速报警系统显示我国出口的茶叶近年来曾多次因氟虫腈农残超标而被通报[12]。目前，备受推崇的稻渔共作模式增加了稻田水产品受到农田中氟虫腈污染的风险，因此氟虫腈及其代谢物残留的检测方法值得深入探究。

图1 氟虫腈及其代谢物化学结构式Fig.1 Chemical structures of fipronil and its metabolites

由于2017年欧盟爆发的“氟虫腈毒鸡蛋”事件，氟虫腈已成为食品中农药残留检测的热点，为了更好地保障我国稻田水产品的质量安全，维护品牌形象，规避贸易壁垒的风险，建立检测稻田水产品中氟虫腈及其代谢物快速筛查方法尤为必要。但目前氟虫腈及其代谢物的检测主要针对植物源性食品、鸡蛋及猪肉等样品[13-15]，检测方法有气相色谱（gas chromatography，GC）[16-18]、气相色谱-质谱（gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）[19-20]及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[14-15,21]等，鲜见水产品中氟虫腈及其代谢物残留检测方法的报道。吕磊等[18]仅报道了水产品中氟虫腈原药的分散固相萃取-气相色谱（solid phase extraction-gas chromatography，SPE-GC）法，Zhang Yun等[21]虽报道PriME（process, robustness, improvements,matrix effects, ease of use）-超高效液相色谱-质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）联用法测定海产品中氟虫腈及其代谢物残留的方法，但海产品与稻田水产品的基质成分存在较大差异。由于稻田水产品主打绿色品牌，其品质受到广大消费者的高度关注，但目前检测稻田水产品中氟虫腈及其代谢物残留的方法鲜见报道，因此，为了保障我国稻田水产品的质量安全，本实验建立检测稻田水产品（主要成分为稻花鲤和克氏原螯虾（Procambarus clarkii））中氟虫腈及其代谢物残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，其具有操作简便、快速、灵敏、高效、价格低廉等优点，适用于检测大批量稻田水产品中氟虫腈及其代谢物残留（简称为目标物）。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

按GB/T 30891—2014《水产品抽样规范》，于2018年5—9月按稻花鲤（每份不少于3 尾）、克氏原螯虾（每份虾不少于10 尾），每份样品不少于200 g的方式共采集30 份稻花鲤、30 份克氏原螯虾[22]。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜和氟虫腈砜标准物质（纯度均大于99%） 德国Dr.Ehrenstorfor公司；乙腈、体积分数0.10%甲酸、体积分数0.30%的甲酸、丙酮、正己烷（均为色谱纯） 美国Honeywell公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary-secondary amine，PSA，40～60 目）、C18粉、中性氧化铝粉 美国Agela公司；去离子水Milli-Q去离子水发生器制得；质量分数分别为0.02%、0.05%、0.10%的氨水 天津科密欧试剂厂。

1.2 仪器与设备

6470三重四极杆液质联用仪、1290-6470液相色谱仪、ZORBAX Extend-C18色谱柱及陶瓷均质子 美国Agilent科技公司；IKA MS3 basic旋涡振荡仪 德国IKA公司；TDL-5-A飞鸽牌离心机 上海安亭公司；Milli-Q去离子水发生器 美国Millipore公司；电子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；FP3010料理机 德国博朗公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 标准储备液的配制

准确称取各标准品于棕色容量瓶中并用乙腈溶解，配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于－18 ℃避光保存。

1.3.1.2 混合标准溶液的配制

分别移取0.1 mL标准储备液于10 mL棕色容量瓶中并用乙腈配制成10 µg/mL的混合标准溶液，于－18 ℃避光保存。

1.3.1.3 基质标准工作溶液的配制

根据准确定量样品的需求量取一定体积的混合标准溶液，再用空白基质溶液将混合标准溶液稀释成1 μg/mL质量浓度的基质标准工作溶液，现用现配。

1.3.2 前处理方法

1.3.2.1 样品制备

稻花鲤去鳞，带皮沿背脊取肉部分。克氏原螯虾去头、壳、肠、腺，取肌肉部分。试样切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后均匀混合样品，并用绞肉机将其制备成肉糜，密封后标记，于－20 ℃冷冻保存，备用。

1.3.2.2 提取

准确称取（2±0.02）g肉糜样品于15 mL具塞离心管中，加入陶瓷均质子，加入4 mL体积分数0.10%甲酸-乙腈溶液，旋涡混合2 min，于－4 ℃、5 000 r/min离心5 min，取上清液于10 mL比色管中，重复加入4 mL 0.10%甲酸-乙腈溶液到取上清液之间的提取步骤1 次，合并上清液并定容至刻度线，混匀，备用。

1.3.2.3 净化

取5 mL上清液于10 mL玻璃离心管中，35 ℃水浴氮吹至干，2 mL乙腈定容，取1 mL定容液于2 mL塑料离心管中，加入0.15 g PSA，旋涡振荡1 min，于25 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 µm尼龙滤膜，供HPLC-MS/MS检测。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 HPLC条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Extend-C18柱（2.1 mm×100.0 mm，1.8 µm）；柱温：35 ℃；流动相：A液为0.05%的氨水、B液为乙腈；匀速梯度洗脱条件：0～1 min，70% A、30% B；1～15 min，70%～40% A、30%～60% B；15～17 min，40%～70% A、60%～30% B。进样量：5 µL；流速：0.4 mL/min。

1.3.3.2 质谱条件

电喷雾负离子源；毛细管电压为3.5 kV；扫描模式为多反应监测（multiple reation monitoring，MRM）模式；离子源温度为325 ℃；干燥气流量为10 L/min；雾化气压力为45 psi；鞘气温度为350 ℃；鞘气流量为12 L/min；毛细管电压为3 500 V。氟虫腈及其代谢物的详细质谱参数如表1所示。

表1 检测氟虫腈及其代谢物的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for the detection of fipronil and its metabolites

1.3.4 基质效应的计算

运用HPLC-MS/MS进行检测时，基质效应（matrix effect，ME）的影响可导致目标物发生离子增强或抑制，从而影响定量分析的准确性和重复性。因此实验采用提取净化后添加标样法建立的数学模型评定ME，按照下式计算ME：

式中：ME为基质效应/%；A为建立溶剂标准曲线后获得的线性方程斜率；B为建立基质标准曲线后获得的线性方程斜率。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

以灵敏度和重复性为目标采用安捷伦ZORBAX Extend-C18（2.1 mm×100.0 mm，1.8 µm）色谱柱分离氟虫腈及其代谢物，实验考察了水-甲醇-乙腈体系对化合物峰形及质谱强度的影响，发现水-甲醇体系反压高，且色谱峰分离度及化合物响应重复性均差于水-乙腈体系，因此初步选择水-乙腈体系为流动相。

质谱检测以电喷雾负离子电离源检测作为酸性物质的氟虫腈及其代谢物，向流动相中加入氨水可促进化合物的电离，以增强质谱响应从而提高仪器灵敏度，但贺敏等[23]在检测韭菜与土壤中氟虫腈及其代谢物残留时，发现待测物用酸性流动相检测出的色谱峰形及灵敏度均优于碱性流动相，因此实验分别采用水-乙腈溶液、0.10%甲酸-乙腈及0.10%、0.02%、0.05%的氨水-乙腈溶液作为流动相以考察pH值对样品响应值的影响，所得结果与贺敏等[23]相反，实验发现样品在水-乙腈溶液的条件下响应最低，其次是0.10%甲酸-乙腈溶液，在氨水-乙腈溶液条件的响应最高、稳定性最好，且其响应强度应随氨水浓度的增加而升高，这可能与ME有关，实验所用基质为鱼，而贺敏等[23]所用基质为韭菜和土壤。由于0.10%氨水-乙腈溶液流动相的pH值高达10.8，而流动相中过高的氨水浓度会降低仪器转子密封圈及色谱柱等仪器的使用寿命，因此，在满足分析需求与保护实验器材的前提下，实验确定了检测目标物的最佳条件为0.05%氨水-乙腈溶液为流动相。

2.2 质谱条件的优化

实验采用流动注射单次标准储备液的方式将质量浓度1 mg/L氟虫腈及其代谢物混合标准溶液注入质谱仪中，在负离子模式下对喷雾电压源的碰撞诱导解离电压、离子传输管温度、鞘气和辅助气等离子源参数进行优化，进而确定测定离子源的最佳条件。以化合物的离子峰为母离子，通过优化质谱的最佳碰撞能，进而确定化合物的定量离子和定性离子。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

乙腈、0.10%甲酸-乙腈、正己烷与丙酮溶液是检测食品中氟虫腈及其代谢物残留常用的提取剂[17,24-25]，实验比较了乙腈、0.10%甲酸-乙腈、0.30%甲酸-乙腈及正己烷-丙酮（1∶1，V/V）的提取效率。结果显示酸化乙腈提取效率最高，其次是乙腈，正己烷-丙酮（1∶1）混合液的提取效率最低，酸化乙腈的提取效率随甲酸浓度的增加而下降，结果如图2所示，其原因可能与水产品中脂肪和蛋白含量较高有关，正己烷-丙酮（1∶1）提取液极性较低、脂溶性强，易将水产品的脂类等干扰物萃取出来，因此共萃干扰物多，提取液较浑浊，影响了目标物的离子化，因此回收率偏低且相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）大于50.0%。而乙腈具有较有较理想的彻底溶解目标提取物的能力、提取效率高，对水产品中脂肪等非极性成分的提取能力弱、可沉淀蛋白质，其提取液清澈透明，其中引入的甲酸可抑制作为酸性化合物的氟虫腈及其代谢物解离以提高溶解度，但实验发现乙腈中甲酸体积分数过高会影响回收率，因此选择0.10%甲酸-乙腈为提取溶剂。

图2 不同提取剂对氟虫腈及其代谢物回收率的影响Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of fipronil and its metabolites

2.3.2 提取方法的选择

乙腈可使水产品的蛋白质变性，酸化乙腈提取样品时发现结团严重，样品表面形成的包覆结构阻碍了酸化乙腈与样品的接触，因此回收率低于30.0%。为了解决样品结团的问题，实验比较了均质分散溶剂法和陶瓷均质子旋涡振荡法的提取效率，发现两者回收率均较好，均质分散溶剂法所用的高速均质器的强大剪切力可彻底粉碎提取剂中的结团样品，但均质分散溶剂法1 次只能处理1 个样品，且均质机刀头清洗不当易造成样品的交叉污染。陶瓷均质子旋涡振荡法是在振荡样品的过程中，加入陶瓷均质子，并高速旋转以充分搅拌，同时打碎结团样品，其不仅增强了样品的均匀性、分散性，还提高了目标物回收率、重复性分别至90.1%、8.4%，可见陶瓷均质子旋涡振荡法比法均质分散溶剂法的实验结果更理想。陶瓷均质子旋涡振荡法仅需1 min完成1 次萃取，可批量处理样品，极大地提高了工作效率，因此选陶瓷均质子旋涡振荡法为本实验的萃取方法。

2.3.3 QuEChERS净化方法的优化

QuEChERS净化方法具有便捷、成本低、高效等优点，被广泛用于水产品中多种药物残留的测定[26-28]。鉴于水产品的脂肪、蛋白含量丰富，作为提取剂的酸化乙腈易将水产品中极性较大的杂质提取出来，因此实验比较了可吸附脂类等非极性干扰物的弗罗里硅土、中性氧化铝、C18粉及可吸附有机酸、脂肪酸等极性杂质的乙二胺⁃N⁃丙基硅烷共4 种吸附剂的净化效果。结果显示，弗罗里硅土对杂质去除能力最差、背景干扰大，其次是中性氧化铝粉、PSA与C18粉净化效果最好，净化液色泽澄清、基线平整、无明显干扰峰，如图3所示。在上述实验基础上，进一步考察了不同用量的C18粉、PSA对目标物的影响。如图4所示，氟虫腈及其代谢物回收率随吸附剂用量的增加而降低，当吸附剂为150 mg PSA时，4 种目标物的回收率均达到了在100%左右的最佳水平，且RSD小于15.0%，因此选择PSA作为净化吸附剂，其最佳用量为150 mg。

图3 不同净化剂对提取液的净化效果Fig.3 Effect of different purificants on purification efficiency

图4 C18及PSA不同用量对实验结果的影响Fig.4 Effects of different amounts of C18 and PSA on experimental results

2.4 ME结果

|ME|＜10%时，ME可忽略，用溶剂标准曲线定量即可；10%＜|ME|＜50%时，出现ME增强或减弱现象，用基质标准曲线定量可适当消除ME对定量的影响；|ME|＞50%时，ME对定量的实验结果干扰较大，应优化样品预处理方法使ME＜50%。实验考察了4 种农药在稻花鲤、克氏原螯虾中的ME，由表2可知，氟虫腈及其代谢物的|ME|均＜50%，2 种水产品基质对目标物信号影响除氟虫腈砜呈增强作用外，其余均呈抑制作用，因此实验采用基质匹配标准曲线的方法进行定量计算以降低ME。

表2 基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的比较Table 2Comparison of matrix-matched calibration with solvent calibration

2.5 方法学评价

2.5.1 线性范围、检出限和定量限

基于已优化的分析条件，用空白稻花鲤及克氏原螯虾的萃取基质分别配制质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、20.0、100.0 μg/L的氟虫腈及其代谢物混合标准溶液，经HPLC-MS/MS测定后，以农药定量离子峰面积为纵坐标，农药基质标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。以添加回收样品信噪比为3得方法检出限（limit of detection，LOD），以信噪比为10得方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。4 种样品基质的检测结果如表2所示，氟虫腈及其代谢物在质量浓度0.5～100.0 ng/mL范围内线性良好，线性相关系数均大于0.999，检出限为1.0～1.5 µg/kg，定量限为3.0～5.0 µg/kg，低于欧盟EU 1127/2014[9]对肉类中氟虫腈最大残留限量15 µg/kg及我国GB 2763—2019[10]对禽肉中氟虫腈最大残留限量10 µg/kg的规定。

2.5.2 回收率与精密度

彭婕等[29]研究显示，稻花鲤、克氏原螯虾是我国稻田养殖的主要品种，虾肉中色素含量较高，稻花鲤中脂肪含量相对较高，因此其肌肉成分差异较大，具有较好代表性。实验选择稻花鲤、克氏原螯虾进行加标回收实验，添加C1～C4共4 组含量分别为5.0、15.0、25.0、50.0 µg/kg的标准液，每组含量设置6 个平行实验的同时做空白实验，用基质匹配标准曲线后，运用外标法定量分析，结果见表3。4 种化合物的平均加标回收率在85.2%～112.6%之间，RSD在1.2%～12.4%之间，其均小于15.0%，因此实验方法具有较好的回收率和重复性，符合药物残留检测方法的要求，氟虫腈及其代谢物加标回收色谱如图5所示。

表3 稻花鲤和克氏原螯虾肌肉中4 种农药的回收率和RSD（n=6)Table 3 Average recoveries and RSD for four pesticides in muscles of common carp and Procambarus clarkii cultured in paddy field (n= 6)

图5 加标稻花鲤样品的提取离子色谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms of fipronil and its metabolites

2.6 实际样品检测结果

按实验方法检测60 份稻田养殖水产品中氟虫腈及其代谢物残留，结果如图6所示。2 份稻花鲤样品中检出氟虫腈含量分别为16.9、14.3 µg/kg，克氏原螯虾中无氟虫腈检出，4 份稻花鲤检出含量在3.54～4.59 µg/kg范围内的氟虫腈砜，1 份克氏原螯虾检出含量为10.2 µg/kg的氟虫腈砜，氟甲腈、氟虫腈亚砜在稻花鲤及克氏原螯虾中均无检出。而Zhang Yun等[21]也在浙江省280 份海产品中检出了氟虫腈及氟虫腈砜残留，可见我国水产品存在氟虫腈污染的风险。

图6 实测样品的氟虫氰提取离子色谱图Fig.6 Extracted ion chromatogram of the measured sample of fipronil

3 结 论

本实验建立了检测稻田水产品中氟虫腈及其代谢物残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，其在样品提取时引入陶瓷均质子，有效解决了乙腈导致的样品结块及分散性差的问题，并采用分散剂PSA去除样品杂质，与PRiME-UHPLC-MSMS法及传统前处理方法相比，具有快速、简便、高效、经济、环保等优点，其涵盖了欧盟限量规定EU 1127/2014[9]及GB 2763—2019[10]中有关氟虫腈的全部残留物质的检测需求，可实现稻田水产品中氟虫腈及其代谢物残留的快速分析，为检测与监管稻田水产品中氟虫腈及其代谢物残留提供理论依据和技术支撑。