盐酸可乐定人工抗原的合成及鼠源多抗血清ELISA鉴定

王 耀

曹金博2,3

李铁梅4

庞杏豪1

胡骁飞2

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；3. 西北农林科技大学动物医学院，陕西 咸阳 712100；4. 中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

盐酸可乐定(clonidine hydrochloride，CLO)属于中枢神经系统肾上腺素α2受体激动剂，分子式为C9H10Cl3N3，分子量为266，分子结构式如图1(a)所示。临床上CLO在治疗高血压、心律失常等方面有较好的疗效，同时与中枢神经抑制药、降压药合用具有协同促进作用[1-3]。CLO属于咪唑啉的衍生物，临床上可显著促进激素水平升高，将其添加在动物饲料中可促进禽畜垂体分泌生长激素，进而促进生长，提高瘦肉率[4-6]，是一种新型的瘦肉精类药物。CLO的毒副作用较大，食用一定量含CLO残留的动物源性食品后，将会出现口干、嗜睡、头痛、恶心、呕吐、便秘、心悸等中毒症状，严重者危及生命[7-8]。农业部1519号公告中已经严令禁止在动物饲料及饮水中添加CLO，但仍有不法分子被经济利益驱动，在禽畜养殖中为提高动物生长速度和瘦肉率违法使用CLO，甚至在休药期为掩盖动物病情而继续用药，导致了CLO在动物体内大量残留，对人身健康产生极大威胁。

目前，高效液相色谱法[9]、气相色谱法[10]、高效液相色谱—串联质谱法[11-12]等仪器检测方法已被应用于CLO药物残留检测，此类检测方法虽然在灵敏度、准确度和假阴阳性率方面具有很大的优势，但样品检测需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，且样品前处理操作较为复杂，不适合运输中易破坏的样品和现场高通量样品的快速筛查。而近年来免疫分析检测技术发展迅速，尤其是基于抗原抗体特异性结合的经典酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，不仅操作简单、快速，而且灵敏度高，特异性强，可解决仪器检测方法的局限，实现现场样品的高通量快速筛查[13-14]。而基于免疫分析技术和胶体金示踪技术发展而来的胶体金免疫层析检测试纸(Colloidal gold immunochromatographic strip，ICS)可在5～10 min内实现样品肉眼可见的快速检测，目前，ICS检测方法已被广泛用于各种农兽药、过敏原等残留检测。ELISA和ICS检测方法的关键在于高亲和力单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)的制备，而高亲和力mAb制备的关键在于高免疫原性人工抗原的合成。目前关于CLO的残留检测研究多为色谱检测方法，而免疫学检测方法研究较少，李丹妮等[15]基于兔抗CLO多克隆抗体建立了检测CLO的ELISA检测方法，但该方法在CLO人工抗原合成过程中，采用琥珀酸酣法对CLO半抗原改造温度较高，条件不易控制，过程较为复杂。目前，关于CLO-mAb的制备以及基于CLO-mAb建立的用于检测CLO残留的ELISA和ICS检测方法的研究较少。CLO分子结构上无可用于偶连载体蛋白的活泼基团，试验拟基于结构类似物的交叉反应性原理，以CLO的衍生物盐酸阿可乐定(Apraclonidine hydrochloride，ACLO)[结构式如图1(b)所示]为半抗原，建立一种新的人工抗原偶联方法(戊二醛法)一步合成CLO人工抗原，以期为高亲和力CLO-mAb的制备奠定良好的基础。

图1 CLO和ACLO分子结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

CLO、苯乙醇胺A(PA)、巴氯芬(BA)、沙丁胺醇(SAL)、莱克多巴胺(RAC)：纯度≥99%，美国Sigma公司；

弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)：纯度≥99%，美国Sigma公司；

戊二醛(GA)：纯度50%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)；美国Jackson Immuno Research公司；

稀释液(PBS)、包被液(CBS)、洗涤液(含0.5%吐温-20 的PBS溶液，PBST)、封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)、显色液(TMB)、终止液(2 mol/L的稀硫酸)等：河南省农业科学院动物免疫学重点实验室自制。

1.1.2 仪器与设备

在商业银行理财产品的司法实践中，投资者权益遭受损害的案例屡见不鲜，商业银行忽视甚至侵犯投资者权益的问题主要体现在以下几个方面：

电子天平：BSA224S型，德国Sartorius公司；

酶标仪：Multiskan FC型，美国Thermo Scientific公司；

振荡器：Vortex2型，艾卡仪器设备有限公司；

高速均质乳化机：T8.10型，艾卡仪器设备有限公司；

控温磁力搅拌器：SZCL-2型，巩义市予华仪器有限责任公司；

恒温培养箱：HPX-9052MBE型，上海博迅实业有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV-5100H型，美国Thermo Fisher公司；

电泳仪：DYY-6C型，大连捷迈科贸有限公司；

凝胶成像仪：ChemiDocTMXRS+型，美国Bio-Rad公司。

1.1.3 试验动物

BALB/c小鼠：6～8周龄SPF级，河南省实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 采用GA一步法合成CLO人工抗原[16]，其中免疫抗原(CLO-BSA)合成路线图如图2所示。称取3 mg ACLO溶于0.5 mL 0.1 mol/mL的稀HCl溶液(A液)，2.5 mg BSA溶于1 mL CBS缓冲液(B液)，将A液逐滴滴加到B液中，搅拌均匀。然后向混合液中滴加25%的GA溶液2.6 μL，室温条件避光偶联4 h。反应结束后，将反应液转移到透析袋中，4 ℃条件下用PBS透析3 d，透析结束后，离心去除沉淀，上清保存于-20 ℃备用。包被抗原(CLO-OVA)合成方法同上。

图2 CLO-BSA人工抗原合成路线

1.2.2 人工抗原鉴定

(1) 紫外扫描鉴定：采用紫外扫描法鉴定CLO人工抗原偶联效果，具体操作为：用PBS缓冲液配置浓度一致的CLO-BSA、CLO标准品和BSA稀释液，然后在220～350 nm波长范围内，利用紫外—可见分光光度计分别扫描各稀释液，通过分析紫外吸收光谱中人工抗原特征吸收峰特征及相对CLO标品和BSA载体变化，判断偶联效果。

(2) SDS-PAGE鉴定：参照文献[17]配置电泳所需5%的浓缩胶和12%的分离胶，选择浓缩胶和分离胶电压分别为60，90 V，上样量为10 μL(含人工抗原5 μg)。跑胶结束后用考马斯亮蓝染液染色3～4 h，脱色液脱色6 h，最后用凝胶成像仪扫描拍照，根据电泳条带位置差异判断偶联效果。

1.2.3 鼠源多抗血清的制备与鉴定 选择4只6周龄雌性BALB/c小鼠，采用背部皮下注射方法进行免疫。首免为基础免疫，将免疫抗原用无菌PBS稀释后与等体积FCA混合，乳化器充分乳化至乳白色且在水中无明显扩散现象时进行免疫，免疫剂量为200 μL/只(含30 μg CLO-BSA)。首免3周后，进行加强免疫，其中免疫佐剂FCA用FIA代替，在第4次加强免疫10 d后断尾采血，用CLO-OVA包被ELISA板鉴定多抗血清效价、敏感性和特异性。

(1) 鼠源多抗血清效价测定：采用间接ELISA(i-ELISA)方法[18]测定CLO多抗血清效价。具体操作为：用CBS包被缓冲液将CLO-OVA稀释成1 mg/mL的稀释液，每孔100 μL加入ELISA板中，4 ℃进行过夜包被，然后用PBST洗涤液洗板4次，甩干孔内液体后每孔加入250 μL封闭液，37 ℃孵育1 h，PBST洗板甩干后于4 ℃保存备用。检测时取CLO-OVA包被好的ELISA板，每孔加入100 μL PBS铺底，首孔加入100 μL小鼠多抗血清，倍比稀释至倒数第二孔(阳性孔)，最后一孔不加血清设为空白对照(共12个孔)，37 ℃孵育15 min后用PBST洗板。甩干孔内液体后，每孔加入100 μL的GaMIgG-HRP稀释液(封闭液稀释1 000倍)，37 ℃孵育30 min后用PBST洗板、甩干。然后每孔加入100 μL TMB显色液，室温条件下避光显色10 min，最后每孔加入100 μL终止液，马上在酶标仪中读取OD450 nm值。阳性判定标准为：待测孔OD450 nm值大于空白孔OD450 nm值的2.1倍。以阳性孔最小OD450 nm值所对应的多抗血清稀释倍数作为血清效价。

(2) 鼠源多抗血清敏感性鉴定：采用间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法[19]鉴定CLO多抗血清敏感性。具体操作为：取CLO-OVA包被的ELISA板，将CLO标准品用PBS倍比稀释至不同的质量浓度(500.000，250.000，125.000，62.500，31.250，15.625，7.813，3.906，1.953，0.977，0.000 ng/mL)，每孔100 μL加入ELISA板中，最后一孔加入100 μL PBS(空白对照)，然后每孔加入100 μL一定稀释度的CLO多抗血清(效价测定时OD450 nm为1.2左右)至倒数第二孔，37 ℃孵育15 min。其他操作步骤与效价测定相同。绘制多抗血清对CLO的标准抑制曲线时，以B/B0为纵坐标(B和B0分别为CLO阳性孔和CLO质量浓度为0时的OD450 nm值)，以CLO质量浓度的对数值为横坐标。最后由标准曲线回归方程计算多抗血清对CLO的半数抑制浓度(IC50)，并以此来评价多抗血清的敏感性。

(3) 鼠源多抗血清特异性鉴定：选择几种常见的瘦肉精类药物(PA、BA、SAL、RAC)作为竞争物，利用ic-ELISA鉴定多抗血清的特异性，以交叉反应率(CR)来评价多抗血清特异性，CR越低说明特异性越强[20]。

1.3 数据处理

对所得的数据利用Graphpad Prism 8.0进行处理，对分子结构式及合成路线图用ChemDraw Pro 18.0进行绘制。

2 结果与分析

2.1 人工抗原鉴定

2.1.1 UV鉴定 CLO为小分子半抗原，单独不具备免疫原性，无法直接刺激机体产生免疫应答反应，而通过与大分子载体蛋白(BSA、OVA等)偶联合成的人工抗原后则可获得免疫原性。CLO分子上无可直接用于偶联的活性基团，试验以苯环4位上引入胺基的CLO的衍生物ACLO为半抗原，采用GA一步法将ACLO与载体蛋白偶联合成新的CLO人工抗原，反应条件温和，操作简单。同时为最大程度地避免自连反应的发生，严格控制各反应物摩尔比(nACLO∶nBSA∶nGA=1∶1∶1)。然后利用UV法对合成的人工抗原进行初步鉴定，结果如图3所示，BSA、OVA的特征吸收峰均出现在280 nm处左右，CLO在270 nm处出现特征吸收峰，CLO-BSA在270 nm处左右出现特征吸收峰，相比载体蛋白发生明显偏移，相比CLO略发生偏移。CLO-OVA在260 nm处出现特征吸收峰，相比载体蛋白和CLO均发生明显偏移。特征吸收峰的变化是由于分子内特征基团变化引起的，即ACLO与载体蛋白偶联导致原有基团发生变化，也间接证明人工抗原偶联成功。

2.1.2 SDS-PAGE鉴定 如图4所示，BSA在63 kDa处出现电泳条带，而CLO-BSA的电泳条相比BSA略微向上，说明其迁移距离小于BSA，这是由于合成的人工抗原CLO-BSA的分子量大于BSA的缘故，同样也间接证明CLO成功偶联到载体蛋白上。

2.2 多抗血清鉴定

2.2.1 效价 如表1所示，免疫的4只BALB/c小鼠，其多抗血清效价均在1∶12 800以上，3号小鼠血清效价最高，可达1∶25 600以上，说明免疫抗原在小鼠体内成功刺激机体免疫应答，产生相应抗体。但CLO为小分子半抗原，还需通过敏感性试验进一步验证多抗血清是否能够识别并结合CLO。

图3 BSA、OVA、CLO-BSA、CLO-OVA、CLO紫外扫描图

图4 CLO-BSA的SDS-PAGE鉴定结果

表1 CLO多抗血清效价测定结果

2.2.2 敏感性 如表2所示，免疫的4只小鼠所获得的多抗血清均可特异性识别并结合CLO，对其具有显著的抑制作用，其抑制曲线如图5所示，4只小鼠多抗血清对CLO的IC50分别为153.90，94.58，82.75，139.05 ng/mL，其中多抗血清敏感性最好的是3号小鼠，多抗血清对CLO的标准抑制曲线线性回归方程为y=-0.273 6x+1.024 7，R2=0.979 2，可选择3号小鼠作为细胞融合小鼠，后期可通过细胞融合和单克隆抗体筛选技术制备CLO-mAb。

敏感性鉴定结果最终确证ACLO成功偶联到载体蛋白上，获得了较好的免疫原性，暴露的抗原位点成功刺激机体免疫应答，产生了敏感性较好的CLO多克隆抗体。

表2 CLO多抗血清间接竞争ELISA测定结果

图5 多抗血清对CLO的间接竞争ELISA抑制曲线

2.2.3 特异性 选择敏感性最好的3号小鼠多抗血清与其他竞争物进行交叉反应试验，试验结果表明(表3)，多抗血清仅能特异性识别CLO，与PA、BA、SAL、RAC不存在交叉反应，具有较高的特异性。同时也表明，基于此后期所制备的CLO-mAb，在实际应用于ELISA、ICA检测方法时，也将能专一性检测CLO残留，有效排除其他瘦肉精类药物的干扰。

表3 CLO多抗血清特异性鉴定结果

3 结论

盐酸可乐定作为在禽畜养殖中严令禁止添加的一种新型瘦肉精类药物，其免疫学快速检测方法(酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析试纸检测)在实际样品现场高通量快速筛查中发挥着至关重要的作用，酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析试纸检测方法建立的关键在于高免疫原性人工抗原的合成和高亲和力单克隆抗体的制备。试验采用戊二醛一步法成功合成高免疫原性的盐酸可乐定人工抗原，相比前人研究，合成方法更加简单，免疫小鼠后获得的多抗血清效价高达1∶25 600以上，并能特异性识别盐酸可乐定(半数抑制质量浓度为82.75 ng/mL)，与其他几种常见的瘦肉精类药物无交叉反应，具有较高的特异性。基于制备的盐酸可乐定高亲和力单克隆抗体可建立快速检测盐酸可乐定残留的酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析试纸检测方法，为盐酸可乐定残留监控提供有力的技术手段。