嗜热稠油油藏本源微生物多样性及提高原油采收率应用潜力

张文达，柴陆军 ，张 凡 ，董 浩，孙姗姗，喻高明，顾永安，佘跃惠*

(1.长江大学石油工程学院，湖北 武汉430100；2.非常规油气湖北省协同创新中心,湖北 武汉 430100；3.中国地质大学(北京)能源学院，北京 100083)

近年来，中国、俄罗斯和美国的研究人员开发了微生物提高原油采收率(MEOR)技术，并成功应用于含轻质常规原油油藏[1-3]。微生物产生的气体、酸、溶剂、聚合物和生物表面活性剂具有与其合成类似物相似的驱油性能。目前，关于稠油油藏MEOR技术的研究相对较少，稠油油藏的微生物生态学和控制油藏石油生物降解的因素是面临的主要课题[4]。在实验室条件下和储层中均显示具有硫酸盐还原作用和产甲烷作用的群落具有生物降解稠油组分的能力[5-8]。

研究者研究了我国大港高温(56.9～59.4 ℃)稠油油藏中嗜热微生物群落的代谢特征，并进行了3个油藏区块(孔店北二区块和一北区块及港西油田)现场试验[6-8]。在以高温复杂的地质条件和密度为0.955～0.969 g·cm-3的稠油为特征的孔店油藏，MEOR技术采用将氧气作为空气-水混合物或H2O2与氮和磷矿物质的水溶液一起注入，以激活油田本源微生物群落[7]。注水井近井地带稠油被微生物氧化形成低级醇和挥发性脂肪酸，随后被深部油藏厌氧微生物利用，产生气体CH4、CO2等。在室内培养和油藏现场试验中都观察到生物表面活性剂的产生，导致地层水的表面张力降低。位于孔店油藏北区的生产油井产出的原油黏度从501.2 mPa·s降至458.9 mPa·s，下降了11%，原油中蜡含量从6.64%降至4.72%[7]。在高温油藏条件下，发现在互营营养菌-乙酸氧化菌和利用H2的产甲烷菌的培养过程中，由乙酸产生甲烷；从产甲烷富集培养物中分离出Thermoanaerobacterethanolicus1017-7b菌株和利用H2产甲烷菌株MethanothermobacterthermautotrophicusKZ3的纯培养物；尽管这些菌株均无法在乙酸盐中单独培养，但其混合培养物中有甲烷生成[8]。大港油田的3个MEOR试验区块共增产46 152 t原油，表明以高温油田的稠油驱替为目的的油藏本源微生物活化技术具有很高的驱油效率[7]。MEOR技术在低温稠油储层中的应用也取得良好效果。在我国新疆六中区进行的现场试验中，向储层中注入了空气、糖蜜和无机矿物盐，启动了本源微生物提高原油采收率(IMEOR)的现场试验，增产1 872 t稠油[9]。稠油采收率的改善主要是由于激活了假单胞菌产生物表面活性剂代谢产物。除大港和新疆油田外，在我国胜利油田、辽河油田以及华北油田部分稠油区块的MEOR现场试验也取得了良好的效果，说明MEOR具有极大的应用潜力[1,3]。

为深入了解嗜热稠油油藏本源微生物，作者采用16S rRNA基因克隆文库方法对某85 ℃嗜热稠油油藏3口油井的微生物群落多样性进行研究，并探究其提高原油采收率的潜力，为开展嗜热稠油油藏IMEOR的现场应用提供依据。

1 实验

1.1 样品、试剂与仪器

采出液采自我国东部油田某区块嗜热稠油油藏油井Y12、Y8、Y68井口，油井原始地层温度82.5～86.0 ℃，采出液置于500 mL无菌瓶中，取样后24 h内运送至实验室。

引物27F、1492R、T7、SP6，北京中科希林生物科技有限责任公司；DNA试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、10×buffer、dNTP和Taq酶，天根生化(北京)生物科技有限公司；T载体(pGEM T-Easy)和感受态细胞(Tram1-T1 competent cells)，北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶HaeⅢ和HinfⅠ(Takara)，宝生物工程(大连)有限公司。

3K15型离心机，德国Sigma；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；SNB-1A-J型高温旋转数显黏度计，上海方瑞仪器公司；3H-2000TD型石油密度仪，贝士德仪器科技(北京)有限公司；DIONEX ICS2000型离子色谱仪，戴安中国有限公司；PTC-200型PCR仪，MJ Research； LS-50LJ型立式压力蒸汽灭菌器；测序仪，诺赛基因组研究中心有限公司。

1.2 油井采出液的物性测定

参照文献[10]测定嗜热稠油油藏油井Y12、Y8、Y68采出液原油黏度、原油密度、原油凝固点和采出液总矿化度。

1.3 总DNA的提取

根据细菌基因组试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)说明提取油井样品基因组DNA，每个样品做3个重复，合并3次抽提总DNA样品。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和抽提质量。

1.4 16S rRNA基因全长扩增

使用16S rDNA片段扩增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，从基因组总DNA中扩增16S rDNA片段。PCR扩增体系及程序参照文献[11]。

1.5 克隆文库的建立

用琼脂糖凝胶回收试剂盒对16S rDNA扩增产物进行纯化。然后将回收产物16S rDNA片段pGEM T-Easy克隆载体(Promega)通过化学法转化到感受态细胞。从3个文库(Y12、Y8和Y68)各挑取100个白斑克隆，以少量菌体作为模板通过载体通用引物T7/SP6扩增来检测阳性克隆。PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ和HinfⅠ进行酶切，再用2%琼脂糖凝胶电泳分析限制性片段，最后对电泳图谱进行限制性酶切片段多态性分析(ARDRA)[12]。将酶切图谱相同的克隆归为一种分类操作单元(OTU)。通过Rarefaction分析软件对克隆文库的库容饱和度进行分析。

1.6 测序和构建系统发育树

挑取ARDRA分型归为一类的代表性克隆接种于含有氨苄青霉素(100 μg·mL-1)的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养后送上海美吉生物测序公司测序。通过DNAMAN软件对所得序列进行处理，然后在NCBI(National Center for Biotechnology)数据库中比对分析，依据亲缘关系最近的序列用Clustalx version 1.83和MEGA version 4.1软件构建系统发育树[13-14]。

2 结果与讨论

2.1 嗜热油藏油井的物性分析

嗜热油田构造上处于济阳凹陷中央隆起带东段，油田呈狭长状，东西长28 km，南北宽7.7 km，由一鞍部连接起来的两个背斜构造组成，并被断块复杂化。该油田构造复杂，断层发育，断块多，含油面积小。原油性质以中、低黏度为主，夹带部分稠油。根据油井物性分析(表1)，3口油井属于常规稠油油藏。

表1 嗜热油藏油井的物性参数

2.2 油井克隆文库库容分析

从油井Y12、Y8和Y68采出液的16S rRNA基因克隆文库Y12、Y8和Y68各选择100个阳性克隆子，通过HaeⅢ和HinfⅠ双酶切分型分别得到29、23和45个OTU。克隆文库Y68比Y12、Y8含有更多的菌群。Rarefaction分析曲线表明，当克隆文库Y12和Y8的阳性克隆子达到90个时，曲线趋于平稳，说明克隆文库Y12和Y8能够反映油井Y12和Y8采出液的菌群多样性；而克隆文库Y68的曲线仍趋上升，说明克隆文库Y68挑取的阳性克隆子不足以反映油井Y68采出液的菌群多样性。

2.3 油井的菌群多样性

克隆文库Y12、Y8和Y68属水平上菌群多样性如图1所示，16S rRNA基因克隆文库Y12、Y8和Y68的系统发育树如图2～4所示。

由图1可知，克隆文库Y12、Y8和Y68的菌群多样性存在差异。首先，在细菌属水平比较，克隆文库Y12、Y8和Y68共存8个OTU；克隆文库Y12和Y8共存9个OTU；克隆文库Y12和Y68共存16个OTU；克隆文库Y8和Y68共存10个OTU。其次，克隆文库Y12、Y8和Y68的优势菌分别为海杆菌(Marinobacter)(占38%)、Caenispirillum(占34%)和Prolixibacter(占37%)。海杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、未分类细菌和肠杆菌(Enterobacter)共存于3口油井采出液中。但是肠杆菌的生理生化特性与油藏极端环境不符，可能是在井筒中或者井口装置中生存的微生物。

图1 克隆文库Y12、Y8和Y68属水平上菌群多样性Fig.1 Community diversity in clone libraries Y12，Y8 and Y68 at genus level

图2 16S rRNA基因克隆文库Y12的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of clone library Y12

图3 16S rRNA基因克隆文库Y8的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of clone library Y8

由图2～4可知，克隆文库Y12、Y8和Y68所得序列与GenBank中已有的16S rDNA序列同源性小于97%，共存的未分类细菌表明采出液中存在未报道的新菌，例如，克隆文库Y12和Y8的Y12-9和Y8-16 OTU对应序列的比对结果为Caenispirillumbisanense(93%和96%序列相似度)；克隆文库Y12、Y8和Y68的Y12-14、Y8-23、Y68-9和Y68-28 OTU对应序列的比对结果为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(92%～95%序列相似度)；克隆文库Y68的Y68-12、Y68-36和Y68-45 OTU对应序列的比对结果分别为Oreniamarismortui(96%序列相似度)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)(94%序列相似度)和Prolixibacterbellariivorans(95%序列相似度)。因此，该油藏含有未报道的新菌。

2.4 讨论

2.4.1 采油功能菌海杆菌

在油井Y12、Y8和Y68采出液微生物群落中存在降解石油烃和产生物表面活性剂菌、产酸产气发酵菌、硝酸盐还原菌(NRB)和铁还原菌(IRB)等采油功能菌群，它们都有助于MEOR。降解石油烃和产生物表面活性剂的菌群，如海杆菌[15]占克隆文库Y12的38%，为该油藏的主要优势菌。研究[16-17]表明，该菌为分离于石油化工厂附近的地中海海水中度嗜盐菌，能够降解石油烃尤其是芳香烃,还能产生物表面活性剂，促进烃类化合物溶解，加速烃类降解；Tripathi等[18]从海洋溢油环境中分离的Marinobacter能产生物表面活性剂，其中菌株MCTG107b的表面活性最高，可将培养液的表面张力由71 mN·m-1显著降至31 mN·m-1，并产生稳定的煤油乳液(最大乳化指数EI24为40%)。在优化培养基中培养96 h后，MarinobacterMCTG107b产(740±28.3) mg·L-1的生物表面活性剂。采用HPLC-MS和串联MS对该生物表面活性剂进行表征，发现它是脂肪族链(从C8到C14不等)和具有不饱和键的各种鼠李糖脂同系物的混合物，其中鼠李糖脂为双鼠李糖脂，Rha-Rha-C10-C10是最主要的同系物。鼠李糖脂是研究最为深入的一种生物表面活性剂，具有很高的表面活性和原油乳化能力，尤其是双鼠李糖脂，具有极低的临界胶束浓度和良好的生物利用度。因此，由Marinobacter生产鼠李糖脂具有非常好的工业应用前景。

图4 16S rRNA基因克隆文库Y68的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of clone library Y68

2.4.2 采油功能菌铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌占克隆文库Y8的19%。大多数高温和低温油田中都存在铜绿假单胞菌，该菌株能够降解原油中各种石油烃，并且产生物表面活性剂鼠李糖脂,是一种主要的采油功能菌。铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂混合物一般包含4～28种同系物，能使水的表面张力从72 mN·m-1降到28 mN·m-1，油水界面张力由41 mN·m-1降到1 mN·m-1以下,EI24达90%[19-22]。

Samir等[23]从位于苏伊士湾的埃及油田生产的原油中分离出本源铜绿假单胞菌，该细菌具有以下特征：圆形，粒状，完整，扁平，无色，半透明，厌氧，负性，短杆状，无孢子，不耐酸。他们研究了一种新的培养基，使其能够承受高温和高盐度的恶劣储藏条件，耐受矿化度达到1.5×105mg·L-1，在70 ℃高温油田模拟试验中提高原油采收率达到20%，产生的鼠李糖脂具有稳定乳化稠油作用。

2.4.3 发酵菌、硝酸盐还原菌(NRB)和铁还原菌(IRB)

从3口油井采出液中还检测出产酸产气发酵菌，利用硝酸盐和三价铁作为电子受体的本源菌。仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)占克隆文库Y68的1%，分离于中国山东仙河石油污染盐碱土，是一种降解多环芳烃的海洋细菌，最适合3%～6%盐度，兼性厌氧条件下利用硝酸盐作为电子受体[24]，好氧生长但不利用葡萄糖发酵和厌氧生长能够利用硝酸盐产N2。利用底物发酵产酸产气的菌群，如Pelagibacteriumhalotolerans占克隆文库Y12的1%，源于我国东海海水样品，好氧耐盐(盐度3%～4%)菌，能够利用葡萄糖发酵[25]。P.bellariivorans占克隆文库Y68的37%，分离于海洋沉积物，好氧嗜冷菌，兼性厌氧菌，发酵糖产酸[26]。Halanaerobiumkushneri占克隆文库Y68的1%，分离于美国俄克拉荷马州油田污水，可利用各种糖类，如利用葡萄糖发酵产乙醇、乙酸、H2和CO2，严格厌氧中度嗜盐(盐度15%～20%)厌氧细菌[27]。发酵菌Geoalkalibactersubterraneus源于美国犹他州Red Wash油田，严格厌氧Fe(Ⅲ)-和锰(Ⅳ)-还原菌，能够利用硝酸盐作为能量来源，以各种有机酸、醇、H2作为电子受体[28]。其它功能菌株，例如硝酸盐还原菌Halomonasxinjiangensis占克隆文库Y8的1%，分离于中国新疆盐湖水样，具有硝酸盐还原功能的好氧中度嗜盐(盐度5%～10%)菌[29]。耐盐菌Martelellamediterranea占克隆文库Y12的4%，分离于西班牙马略卡岛地下盐水湖水样，严格好氧耐盐(盐度5%)菌[30]。这些菌群的生理性质与该嗜热油藏油井采出液的高矿化度相吻合。

Tsesmetzis等[31]从东南亚某95 ℃嗜热储层的3个层段(井深2 800～2 900 m)岩心样品得出的本源微生物特征表明，硝酸盐还原可能是深部油藏一个重要的原位过程。该油藏16S rRNA基因克隆文库的OTU分类学分析发现，来自草杆菌科的比例很高(38.5%)，其次是假单胞菌科和Comamonadaceae科(分别为29.1%和12.8%)。已知这些科的代表种都能在厌氧条件下降解碳氢化合物并使用硝酸盐作为末端电子受体。Gittel等[32]研究了80 ℃嗜热油藏采用硝酸盐还原菌抑制硫酸盐还原菌(SRB)的现场应用效果，16S rRNA基因克隆文库结果表明，该嗜热油藏古菌主要为古球状菌属，硝酸盐处理后激活的主要为硝酸盐还原菌群如脱铁杆菌属，硫酸盐还原活性被完全抑制。本研究中嗜热稠油油藏含有本源硝酸盐还原菌结果与之相符，这种生物抑制SRB技术在国外海上油田应用非常普遍，表明能通过激活硝酸盐还原菌，控制SRB产H2S进而提高原油采收率。

Kim等[33]通过大洋钻探计划80 ℃地层取样分析，证明天然发生的微生物诱导的蒙脱石-伊利石(S-I)反应，微生物在地下引起的S-I反应是产甲烷菌和SRB活动的结果，地层本源微生物通过减少蒙脱石中的Fe(Ⅲ)结构获得能量，从而促进S-I反应，导致地层孔隙度增加，表明铁还原过程也是深部地层一个非常普遍的自然过程。早期文献报道了从不同温度油藏分离到铁还原菌，表明铁还原微生物和铁还原过程在油藏中普遍存在，最高温度达到85 ℃(西西伯利亚油田)[34]。苏三宝等[35-36]采用高通量测序技术分析了我国多个油田铁还原微生物多样性，表明40～100 ℃(江汉油田)油藏中都含有丰富的铁还原菌，与粘土矿物相互作用，促进蒙脱石向伊利石转化，提高油藏地层渗透性，改善注入水波及效率，在MEOR方面具有广泛的应用前景。翁雪等[37]综述了油藏铁还原菌的研究进展及其在MEOR方面的潜在应用；Cui等[38]研究了低渗透油藏微生物促进蒙脱石向伊利石转化；胡小丽等[39]研究了油藏嗜热菌与粘土矿物的作用和储层防膨及提高原油采收率的应用前景。这些研究表明，油藏铁还原菌在油藏中分布广泛，在油藏环境下微生物与矿物相互作用，改善地层渗透性，为MEOR机理研究指明了一个新的研究方向。

2.4.4 嗜热油藏微生物代谢活动和IMEOR的启示

营养物质和可降解底物的可利用性是地下环境中微生物生长和活性的最大限制因素[3]。然而，在深层生物圈的大范围内养分和基质较差的沉积物中，油藏可能被认为是微生物生长的绿洲。油藏中含有大量的碳氢化合物和/或气体沉积物，它们可以被微生物降解并用作碳源[3]。 此外，原油中含硫和氮的化合物(例如苯并噻吩和苯并咔唑)可能为这些活动提供营养来源[40]。因此，与其它深层生物圈生境相比，油藏中的本源微生物活性更高，尤其是在油柱底部的油水过渡带[4,41]。Jones等在4 km深的储层中观察到了重油生物降解的最大特征[5]；Fry等[42]在钻探探井发现了距海床以下2 km的煤页岩中的细菌。这些微生物的存在和代谢活动为IMEOR提供了依据。

Rathi等[43]报道了激活70～100 ℃嗜热油藏的本源厌氧微生物提高原油采收率的潜力，在高温下富集培养嗜热产甲烷菌群，主要的嗜热菌为Methanothermobaterthermoautotrophicus(古菌)、Thermoanaerobactersp.(细菌)，在优化培养后产酸产气和产生物表面活性剂，表面张力从65 mN·m-1降到35 mN·m-1，原油采收率提高了15.49%。Liu等[44]从高温(87 ℃)油藏的生产水中分离出一种嗜热孢子兼性厌氧细菌，其生理、生化和16S rRNA基因的系统发育树分析表明，该菌属于无氧杆菌属。在实验室条件下，该菌与脱硫醇假丝酵母(Desulfotomaculumsp.)共培养时，能显著抑制H2S的产生，表明其在抑制油藏盐水酸浸和控制SRB引起的生物酸化方面具有很大的潜力。

梁凤来等[10]报道了解烃细菌NX-2在华北油田马二断块的现场试验。在缺氧条件下该菌产酸产气和产生物表面活性剂鼠李糖脂，在油藏温度(87 ℃)条件下岩心物理模拟驱油实验表明,微生物驱较水驱提高原油采收率7.1%。在马2-410油井进行的吞吐处理试验,共增产原油669 t,少产水超过3 000 t,表明NX-2菌适应地层条件,具有增采和改善原油性质的作用。Du等[45]、刘涛等[46]报道了我国胜利油田辛 68区块微生物驱油现场试验，该油藏为深部稠油油藏，具有较高的温度和含盐量。该油藏原始地层温度89～93 ℃，平均孔隙度26.7%，平均渗透率813×10-3μm2，原油黏度321 mPa·s。2016～2018年共注入4 048 t长链碳源如淀粉水解液活化剂。在实施MEOR之前，主要细菌为无色杆菌、沙雷氏菌、嗜热菌和热产乙酸菌。注入活化剂后，嗜热厌氧芽孢杆菌和不动杆菌增加。同时，注水曲线得到改善，注入指数的差异减小，所产液体的表面张力逐渐降低。这表明本源细菌被选择性激活并产生了有利于采油的代谢产物。累计增产量为5 453 t，日产原油从10.7 t·d-1增至19.7 t·d-1，含水率从95.1%降至80.7%，采收率提高了1.39%。

加利福尼亚豪泽组油田地层温度88～93 ℃，矿化度1.42×105mg·L-1,试验前，油井产原油4.4 m3·d-1，产水30.3 m3·d-1；微生物单井处理3个月后，平均产原油12.5 m3·d-1，产水30.3 m3·d-1，高峰时产油达到17.8 m3·d-1，累计增产原油4 500桶[47]。

以上应用研究表明，80 ℃以上嗜热油藏含有解烃产表面活性剂菌、产酸产气菌以及嗜热古菌，对研究嗜热稠油油藏本源微生物及IMEOR应用潜力具有重要意义，说明嗜热稠油油藏也含有丰富的采油功能菌，具备开展IMEOR现场应用研究的生物学基础。

3 结论

(1) 嗜热油藏油井物性分析表明，3口油井属于常规稠油油藏。

(2) 采用16S rRNA基因克隆文库方法研究了嗜热油藏3口油井(Y12、Y8和Y68)采出液的微生物菌群多样性，表明该地层含有丰富的采油功能菌，如海杆菌、假单胞菌、海旋菌等，能降解各种石油烃，同时产生物表面活性剂，激活后有利于提高原油采收率。此外，该油藏还含有嗜热发酵菌(Caenispirillum和Prolixibacter)、硝酸盐还原菌(NRB)和铁还原菌(IRB)。海杆菌和假单胞菌都能产生物表面活性剂,从而促进烃类溶解，降低稠油黏度和乳化分散原油；嗜热厌氧发酵菌能产酸产气；NRB能控制硫酸盐还原菌产硫化物沉淀；IRB能促进粘土矿物由蒙脱石向伊利石转化，提高地层渗透率。这些功能微生物及其代谢活动都有助于提高原油采收率，表明IMEOR在嗜热油藏的应用具有广阔应用前景。