桑叶黄酮类化合物的研究进展

罗文涛，冯菊红*，王理想，何少男，孙锟辉，刘 祺，胡学雷

(1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074；2.绿色化工过程教育部重点实验室，湖北 武汉 430074)

桑叶又名冬桑叶、霜桑叶、铁扇子、枯桑叶等，是桑科植物桑(MorusalbaL.)的叶子。我国是世界上最早种植桑树的国家，桑树在我国大部分地区多有种植，尤其是长江中下游地区和四川盆地。桑叶产量丰富，除了作为蚕的主要食物外，也是一种重要的中药材和保健食品。桑叶作为中药使用已有4 000多年的历史，在世界上第一部药典《唐本草》中记载了桑叶的药用功效。桑叶味甘、苦，性寒，能疏散风热，热肺润燥，清肝明目，平抑肝阳。桑叶中含有多种药理活性成分，主要是黄酮类、生物碱类、甾体和多糖类化合物。其中，黄酮类化合物的含量占桑叶干重的2%左右，是桑叶中化学成分研究最多、化学结构明确的一类天然产物。黄酮类化合物的基本骨架为2-苯基色原酮(图1)。

图1 黄酮类化合物的基本骨架Fig.1 Basic skeleton of flavonoids

桑叶黄酮类化合物(mulberry leaf flavonoids,MLFs)多含酚羟基，显酸性，且其酸性强弱与酚羟基的数目和位置有关。MLFs苷元多为结晶性固体，糖苷化后多为无定形粉末，且糖苷化后水溶性会增强。MLFs主要包括芸香苷、桑色素和槲皮素等，具有抗氧化、抗癌和改善心血管功能等多种药理学作用，有较好的研究价值和应用前景。作者就近15年来MLFs的提取方法、分离纯化方法、含量检测和药理学作用等方面研究进行简要综述。

1 MLFs的提取方法

MLFs的提取方法主要包括有机溶剂法、超声波辅助法、微波辅助法、超临界CO2法等。研究[1]表明，影响MLFs提取的因素主要有提取溶剂、提取温度、提取时间和料液比等。使用不同种类、不同浓度的溶剂提取的MLFs含量有所不同。提取温度对分子热运动有显著影响，当提取温度较低时，溶剂分子运动较缓慢，提取的MLFs含量较低；当提取温度过高时，有可能会破坏MLFs的化学结构。一般情况下，提取时间越长，MLFs溶出越充分，但同时也增加了杂质的溶出。溶剂用量越多，提取的MLFs含量越高，但杂质含量也越高。

1.1 有机溶剂法

传统的水提取法因部分MLFs组分不溶于水，导致MLFs浸出率较低。有机溶剂法使用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂提取，可以提高MLFs含量。该法操作简便，易于放大。Kobus-Cisowska等[2]比较了小分子醇、丙酮和水等溶剂对提取MLFs的影响，结果表明，以丙酮为提取溶剂时，MLFs含量最高；以乙醇为提取溶剂时，MLFs的抗氧化活性最高；以水为提取溶剂时，MLFs的抗氧化活性最低。Cui等[3]优化了MLFs的提取条件，在乙醇体积分数为39.3%、料液比为1∶34.6 (g∶mL，下同)、提取温度为70.85 ℃、提取时间为120.18 min的最优条件下，MLFs含量最高，为50.52 mg·g-1。

1.2 超声波辅助法和微波辅助法

超声波辅助法的原理是当超声波作用于介质时，会产生正负不同的压强相位，撕裂介质，形成空洞，并使温度升高和搅拌加剧，具有提取效率高、耗时较短、可提取热不稳定成分等特点。张齐[4]在提取溶剂为75%乙醇、料液比为1∶25、提取温度为70 ℃的条件下超声提取MLFs 1.5 h，MLFs含量为2.96%。

微波辅助法的原理是介质中的极性分子随电磁场频率的变化而改变排列取向，导致分子运动和摩擦，产生热效应，具有提取效率高、耗时较短、溶剂用量少等特点。陈菁菁等[5]对比了有机溶剂法和微波辅助法对MLFs的提取效果，在提取溶剂为70%乙醇、料液比为1∶12的条件下，当微波辅助功率为450 W、提取温度为60 ℃、提取时间为20 min时，MLFs含量为2.87%；而采用有机溶剂在90 ℃下回流提取2 h，MLFs含量为1.85%，微波辅助法提取MLFs含量更高，较有机溶剂法提高了55%。

超声-微波协同法结合了超声波辅助法和微波辅助法，既有超声波辅助法的空化效应，又有微波辅助法的热效应，具有提取效率高、耗时短等特点。李莉等[6]采用超声-微波协同法提取MLFs，在提取溶剂为65%乙醇、提取功率为400 W、提取时间为12 min、料液比为1∶10的条件下，MLFs含量为3.07%。

1.3 超临界CO2法

超临界CO2法以超临界CO2流体为萃取剂，通过改变CO2流体温度或压强，使超临界CO2流体密度发生变化，进而改变其溶解能力。该法中CO2无毒害作用，且对提取物的破坏较小。王昕宇等[7]采用超临界CO2法萃取MLFs，在压力为35 MPa、温度为45 ℃、夹带剂为200 mL、CO2流量为10 kg·h-1的条件下处理300 g桑叶，MLFs含量为7.68%。表明，超临界CO2法的提取效率优于有机溶剂法，且无溶剂残留，可用于MLFs的大规模提取。

1.4 其它提取方法

熊知行等[8]采用酶法提取MLFs，发现加入纤维素酶能破坏细胞结构，提高MLFs的提取效率。

碱提酸沉法：MLFs为酸性，可用弱碱溶液为提取溶剂进行提取，再在酸性条件下沉淀析出。该法提取的杂质较多，污染较大，若提取溶剂碱性太强，会破坏黄酮母核；若沉淀时酸性太强，会生成烊盐，使MLFs重新溶解。

2 MLFs的分离纯化方法

通过不同方法提取的MLFs是黄酮类化合物的混合物，经初步分离纯化得到MLFs粗品。如果要得到结构单一的黄酮类化合物，需要对MLFs进行进一步分离纯化。

2.1 初步分离纯化

从提取液中分离MLFs粗品主要采用大孔吸附树脂柱层析法。目前，关于大孔吸附树脂方面的研究主要集中于大孔吸附树脂的种类、分离纯化温度、洗脱剂种类及浓度、料液比等的选择和优化。影响树脂吸附性能的因素包括树脂的极性、骨架结构、比表面积和平均孔径大小，以及被吸附物质的极性和分子大小等。一般而言，树脂与分子极性越相似，越易吸附，但越难解析；树脂的相对比表面积越大，吸附能力越强；树脂的相对孔径越大，扩散速度越快，但选择性越低。王俊等[9]采用树脂吸附法分离纯化MLFs，选择H103型树脂固定床，在上样流速为9 mL·min-1、MLFs初始浓度为6.05 mg·mL-1、洗脱剂为60%乙醇、洗脱流速为4.5 mL·min-1的条件下，MLFs收率为90.57%，纯度为76.33%。

除了大孔吸附树脂外，分离MLFs粗品还可用硅胶、聚酰胺、纤维素粉作为吸附剂或载体，此外，氧化铝、氧化镁及硅藻土等也有应用。

2.2 进一步分离纯化

黄酮类化合物的骨架结构、骨架上的酚羟基和糖基等是决定其物化性质的重要因素，使其显示出不同的极性、酸性、分子量和化学反应性。根据这一特性，可采用下列方法对MLFs进行进一步分离纯化，以得到单一组分。

(1)溶剂萃取法：使用不同极性的溶剂，经过反复萃取，分离出不同组分。该法很难直接分离出单一组分，常结合色谱法或重结晶法进一步分离。

(2)色谱法：Ju等[10]采用液质联用法对12种韩国MLFs组分进行了定性和定量分析。其中，含量最高组分的是芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-(6′-O-丙二酰)葡萄糖苷。

(3)梯度pH值萃取法：根据MLFs不同组分的酸性差异，可以采用不同酸性的洗脱剂将其分离。常用洗脱剂有NaHCO3、Na2CO3、稀NaOH和浓NaOH溶液[11]。

(4)高效毛细管电泳(HPCE)法：利用电泳和电渗流现象，不同MLFs组分在不同电场力的作用下被分离。该法分离效率高，进样量极少，其柱效远高于高效液相色谱(HPLC)法。张军等[12]采用HPCE法对不同种类、不同时期的MLFs进行分离和测定，缓冲液为pH 值8.62的磷酸二氢钠和硼砂溶液，温度为25 ℃，压力为20 kV，检测波长为245 nm，8 min内组分分离完全，测得湖桑品种中芦丁和槲皮素含量最高，并且10月份采摘桑叶中芦丁和槲皮素含量最高。

(5)微乳薄层层析法：以微乳为展开剂，用薄膜进行分离。该法分离效果好，灵敏度高。李升锋等[13]采用微乳薄层层析法分离MLFs，将微乳层析液调酸后，经聚酰胺薄膜分离。结果显示，分离出12个斑点，分离效果较好，其中芦丁含量较高。

3 MLFs的含量检测

MLFs含量检测不仅与提取、纯化方法有关，也与桑叶本身所含MLFs含量有关。桑叶的种类、部位以及光照强度、土壤环境和季节变化等都是影响MLFs含量的重要因素[14]。在一定范围内，MLFs含量随光照强度的增大而升高。Krajnc等[15]研究发现，对桑树进行修剪，蛋白质和MLFs含量会升高。Przeor等[16]研究发现，白桑叶在60 ℃下干燥时，MLFs含量最高。

3.1 紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法的原理是部分MLFs能与铝离子发生络合反应显色，其颜色的深浅与MLFs含量呈比例，故可以通过测定吸光度计算MLFs含量。该法具有操作简单、重现性好等特点。穆建峰[17]确定的MLFs最佳提取条件为：料液比1∶20、提取温度70 ℃、提取溶剂50%丙酮、超声时间40 min，并采用硝酸铝显色法测定MLFs含量，检测波长为510 nm，得回归方程为y=11.066x-0.0001(R2=0.9995)，测得MLFs含量为2.78%。张国权等[18]采用三氯化铝比色法测定MLFs含量，检测波长为400 nm，得回归方程为y=0.0298x-0.0018(R2=0.9995)，MLFs含量在0.001～0.016 g·L-1范围内线性关系良好。

3.2 荧光光度法

紫外线照射物质后使其处于激发态，在去激发过程中会发射反映物质特性的荧光，若该物质不发射荧光，可使用荧光染料与其生成络合物。荧光光度法利用这一性质，在有铝离子存在的条件下测定MLFs含量。该法具有灵敏度高、重现性好等特点。王艳[19]采用荧光光度法测定MLFs含量，标准品为芦丁，激发波长为436 nm，发射波长为483 nm，得回归方程为y=17.913x+1.388(R2=0.9999)，检测限为1.36×10-9mol·L-1。

3.3 高效液相色谱法

HPLC法可分离多种组分，并进行定量分析，准确度高，重复性好。Kim等[20]研究发现，经超声处理0.5 h的酸性甲醇是HPLC法检测MLFs的最佳流动相。Zhang等[21]利用手性HPLC分离和检测了MLFs中的立体异构体。Kim等[22]采用酶法提取桑叶有效成分，通过HPLC法分离并检测了5种组分。

4 MLFs的药理学作用

黄酮类化合物具有多种药理学作用，包括改善心血管功能、保护肝脏、抗炎、抗菌、抗病毒、雌激素样作用、泻下作用和解痉作用等[23-24]。

4.1 抗氧化

MLFs具有减少或清除自由基，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性和提高细胞抗氧化能力，减少细胞和组织损伤，进而减少心脑血管疾病、糖尿病、癌症等疾病的发生，延缓衰老和延长寿命。Hosseinzadeh等[25]研究发现，MLFs组分中的芦丁可抑制自由基对肝、胃肠道等的损害。Chon等[26]研究了桑叶提取物中总酚含量与清除自由基能力的关系，结果表明，总酚含量越高，清除自由基能力越强。此外，还有研究[27]表明，桑叶提取物经β-葡萄糖苷酶处理，槲皮素含量明显提高，桑叶提取物的胞内抗氧化能力增强。

4.2 降血脂

MLFs可以抑制肠道内胆固醇的吸收，降低血脂浓度，减少高血脂症的发生。此外，MLFs可通过清除体内自由基、螯合金属离子、影响SOD活性来提高血管内高密度脂蛋白(HDL)与低密度脂蛋白(LDL)的比率，预防动脉粥样硬化。研究[28]表明，MLFs能改善小鼠的肠道环境，调节脂质代谢。Hu等[29]通过大鼠试验，发现MLFs可以通过减少胆固醇的累积治疗肝类疾病。

4.3 降血糖

MLFs可以抑制胰岛β-细胞凋亡，减少血糖摄入，降低血糖浓度。此外，MLFs可通过清除体内多余自由基、提高SOD活性和提高细胞抗氧化能力来减少对肝脏和胰岛细胞的破坏，提高机体降血糖能力。研究[30]表明，MLFs可以调节肠道内菌群，改善由糖尿病引起的并发症。据相关文献[31-32]报道，MLFs可以调节糖代谢，校正高血糖症。Kim等[33]经体外降糖性能实验，发现MLFs具有降糖活性。

4.4 美白

MLFs可以通过抑制体内的酪氨酸酶活性，抑制酪氨酸转化为黑色素，起到美白作用。此外，MLFs可通过清除自由基和提高细胞抗氧化能力，减缓由自由基攻击细胞导致的衰老，延长寿命。邢凯等[34]以MLFs为原料，制备了具有控脂美白效果的面膜，测试了其pH值、热稳定性、黏度、结构稳定性和刺激性。结果表明，面膜的pH值适宜、热稳定性较强、黏度适宜、结构稳定性良好、刺激性适宜，且感官性能评价优良，具有抑制皮肤油脂分泌、美白的功效。

4.5 抗高血压

MLFs中的芦丁和槲皮素等成分具有维生素P样作用，可增强血管柔韧性，改善血管通透性，具有很好的扩冠作用，可起到抗高血压作用。陈迎霞[35]开发了一种含MLFs的中药汤剂，可用于治疗由高血压引起的头晕，还可清热去火，安全性较好。

4.6 其它作用

Thabti等[36]研究表明，MLFs能抵抗新冠病毒。Cai等[37]经大鼠试验，证实饲料中添加桑叶能使动物增重。Tomczyk等[38]发现桑叶能提高淀粉酶活性，丰富蜂蜜营养。研究[39-42]表明，MLFs能增强仔猪对疾病的抵抗力；改善牛的瘤胃环境，抵抗氧化，促进水牛生长；提高鸡蛋蛋黄的黄度；提高家禽消化和繁殖能力，促进家禽生长，提升肉质口感和营养。MLFs可能通过抑制脂氧合酶，改变前列腺素(PEG)的生物合成过程，进而起到抗炎效果。此外，桑叶中的槲皮素、桑色素等具有抗病毒作用。

5 展望

MLFs含量较高，活性较好，且具有多种药理学作用，因而对MLFs的研究已成为学者们关注的热点之一。目前，关于MLFs的研究主要集中在MLFs的提取和分离纯化方面，对于MLFs药理学作用的研究也逐渐增多。今后，可以从以下几个方面对MLFs开展进一步研究：(1)将目前进行的MLFs研究放大应用于实际大规模生产中；(2)采用HPLC法等分离纯化手段分离出MLFs单一组分，并研究单一组分的药理学作用；(3)MLFs的抗氧化作用较强，可进一步研究其体内抗氧化作用；(4)进一步研究MLFs的药理学作用机制，以提高桑叶的利用价值；(5)拓宽MLFs的应用范围，研发相应的食品、饮料、饲料添加剂、化妆品等；(6)研究影响MLFs含量的外在因素，设计更好的培育方法。

总之，桑叶作为一种天然产物，在具有高效的药理学作用的同时，又具有安全、易大量培育和应用广泛等特点，使得MLFs具有广阔的研究前景，对其研究会越来越深入和全面。