3,4-二甲氧基-4′-氯联苄的合成及其抑制HepG2细胞己糖激酶2活性研究

关 丽,赵惠茹,李伟泽*,赵 宁,胡诗寒，刘保林,冯 锋

(1.西安医学院药学院，陕西 西安 710021；2.中国药科大学中药学院,江苏 南京 211198)

肝癌为我国常见恶性肿瘤之一，年死亡率居肿瘤死亡率的第二位。瓦伯格效应(Warburg Effect)指出，正常细胞能量代谢以氧化磷酸化为主，而肿瘤细胞能量以有氧糖酵解为主[1]。根据瓦伯格效应，抑制肿瘤细胞有氧糖酵解能量代谢可能是癌症治疗的有效策略[2-3]。己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)是有氧糖酵解的第一个关键限速酶，主要负责葡萄糖的磷酸化[4]。活性HK2分布在线粒体上以保持线粒体内膜的完整性[5]，防止内膜释放凋亡因子[6]。当药物使HK2从线粒体上脱落时，线粒体膜电位迅速上升，凋亡因子释放，从而诱导凋亡[7]。

石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)植物，杓唇石斛素(moscatilin)是石斛中的代表性联苄类化合物，具有明显的抗肿瘤活性[8-12]。前期研究表明，杓唇石斛素衍生物3,4-二甲氧基-4′-氯联苄(Bd)对HepG2细胞毒性最强。

作者以3,4-二甲氧基苯甲醛(Ⅰ)为原料，通过NaBH4还原醛基、羟基氯代、与三苯基膦反应合成膦叶立德中间体(Ⅳ)，化合物Ⅳ与4-氯苯甲醛缩合得到二苯乙烯衍生物Ⅴ，再经过催化氢化反应合成Bd，合成路线见图1。采用激光共聚焦免疫荧光实验研究Bd对HepG2细胞HK2活性的影响，探讨其抗肝癌的可能机制。

a)NaBH4,EtOH,0 ℃,rt,1 h;b)SOCl2,Et3N,DCM,0 ℃,rt,3 h;c)PPh3,toluene,reflux,6 h;d)4-chlorobenzaldehyde,NaH,

1 实验

1.1 试剂与仪器

合成实验所用化学试剂，阿拉丁；二甲基亚砜(DMSO)，国药集团化学试剂有限公司；HepG2细胞，中国科学院上海生命科学研究院细胞库；己糖激酶2抗体，Abcam；DAPI染色液、线粒体红色荧光染料和FITC标记的山羊抗兔二抗、抗猝灭剂，碧云天生物技术有限公司；柱层析硅胶，上海谱振生物科技有限公司。

Avance 300 MHz型NMR核磁共振仪，Bruker；1100 Series型ESI-MS质谱仪，美国Agilent；GF254型硅胶薄层预制板，青岛海洋化工厂；二氧化碳培养箱，Thermo；TR6000型全自动酶标仪，深圳雷杜；LSM 710型激光共聚焦显微镜，德国Zeiss。

1.2 3,4-二甲氧基-4′-氯联苄(Bd)的合成

1.2.1 3,4-二甲氧基苯乙醇(Ⅱ)的合成

将化合物Ⅰ(10.0 g,0.060 mol) 溶于50 mL EtOH中，冰浴条件下缓慢加入NaBH4(0.84 g,0.022 mol)，室温搅拌1 h，TLC监测反应完全；然后加入5%盐酸调节pH值至7；减压浓缩后，残渣用二氯甲烷萃取(10 mL×3)，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得淡黄色油状化合物Ⅱ9.94 g，产率98.3%。

1.2.2 4-氯甲基-1,2-二甲氧基苯(Ⅲ)的合成

将化合物Ⅱ(9.0 g,0.054 mol) 溶于二氯甲烷(50 mL)中，冰浴下加入三乙胺(7.7 mL,0.055 mol)，再缓慢滴加二氯亚砜(4.3 mL,0.05 mol)，室温搅拌3 h；溶液用蒸馏水洗涤(10 mL×3)，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得亮黄色油状化合物Ⅲ8.57 g，产率85.8%。

1.2.3 (3,4-二甲氧基苄基)三苯基氯化膦(Ⅳ)的合成

将化合物Ⅲ(8.0 g,0.043 mol) 和三苯基膦(11.4 g,0.043 mol)同时溶解于少量甲苯(20 mL)中，加热回流6 h，有大量白色固体析出；冷却至室温后，抽滤，红外灯烘干得白色粉末化合物Ⅳ10.6 g，产率92.3%，m.p.148～151 ℃。

1.2.4 3,4-二甲氧基-4′-氯联苄(Bd)的合成

将化合物Ⅳ(2.0 g,4.454 mmol)和4-氯苯甲醛(0.624 g,4.454 mmol)同时溶解在少量干燥的四氢呋喃(10 mL)中，氩气保护，冰浴条件下缓慢加入NaH(0.116 g,4.833 mmol)，加毕，室温反应过夜；浓缩反应液，得到顺反混合的二苯乙烯衍生物，减压浓缩，溶于10 mL甲醇，加入一小勺10% Pd/C催化氢化反应48 h，得到Bd粗品。经硅胶柱色谱(展开剂：石油醚-丙酮，10∶1)纯化得淡黄色油状化合物Bd，产率61.4%。

1.3 激光共聚焦免疫荧光实验[13]

HepG2细胞消化、计数，配制成浓度为5×104个·mL-1的细胞悬液，置于6孔板进行细胞爬片，然后置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h；弃去培养基，细胞爬片成功后给药，设置化合物Bd(0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)组和空白组培养48 h；PBS清洗2次后，用线粒体红色荧光染料进行线粒体染色20 min；用含3%BSA的PBS封闭细胞2 h，再用己糖激酶2抗体(HK2 antibody)于4 ℃下一起孵育过夜；PBS清洗细胞后，用FITC标记的山羊抗兔二抗染色2 h；PBS清洗细胞3次，每次5 min，并用DAPI染色20 min；PBS清洗细胞3次，每次5 min，加抗猝灭剂在激光共聚焦显微镜下拍片。

2 结果与讨论

2.1 中间体和目标产物的表征

3,4-二甲氧基苯乙醇(Ⅱ)：1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：6.97(1H，d，J=1.8 Hz，H-2),6.87(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.70(1H,dd,J=1.8 Hz、8.1 Hz,H-6),4.61(2H,s,Ar-CH2-),3.83(3H,s,-OCH3),3.75(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：150.1,148.7,121.4,117.7,114.2,112.6,65.1,56.1,56.0;ESI-MS,m/z:169.1[M+H]+。

4-氯甲基-1,2-二甲氧基苯(Ⅲ)：1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：6.97(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.95(1H,dd,J=1.8 Hz、8.1 Hz,H-6),6.86(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.64(2H,s,Ar-CH2-),3.83(3H,s,-OCH3),3.74(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：150.0,149.6,131.1,121.9,113.7,112.6,56.1,56.0,46.5;ESI-MS，m/z：187.1[M+H]+。

(3,4-二甲氧基苄基)三苯基氯化膦(Ⅳ)：1HNMR(300 MHz,DMSO-d6)，δ：7.51～7.49(3H,m,ArH),7.45(6H,dt,J=3.6 Hz、8.1 Hz,ArH),7.15～7.11(6H,m,ArH),6.86(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.82(1H,dd,J=1.8 Hz、8.1 Hz,H-6),6.73(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.86(2H,J=15.0 Hz,Ar-CH2-),3.83(3H,s,-OCH3),3.75(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,DMSO-d6)，δ：149.7,146.8,137.4,136.2,128.8,128.6,122.3,121.4,114.1,112.3,57.8,56.2,56.1;ESI-MS，m/z：483.1[M+Cl]-。

3,4-二甲氧基-4′-氯联苄(Bd)：1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：7.25(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),7.09(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),6.80(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.70(1H,dd,J=1.8 Hz、8.4 Hz,H-5),6.70(1H,d,J=1.8 Hz,H-3),3.88(3H,s,-OCH3),3.85(3H,s,-OCH3),2.86(4H,brs,-CH2CH2-);13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：159.3,156.3,131.4,128.7,127.5,127.3,121.1,115.0,111.8,105.1,56.2,56.1,38.1,37.6;ESI-MS,m/z:314.7[M+K]+。

2.2 抑制HepG2细胞己糖激酶2活性

Bd诱导HK2从线粒体脱落至细胞质的激光共聚焦显微镜照片见图2。

a.对照组 b.0.1 μmol·L-1 Bd c.1 μmol·L-1 Bd

从图2可以看出，在HepG2细胞内，HK2染色为绿色荧光，线粒体染色为红色荧光，核染色为蓝色荧光。对照组Merge照片显示，HK2结合在线粒体上绿色与红色荧光融合为橙色荧光。当用不同浓度的Bd处理HepG2细胞后，随着Bd浓度的升高，橙色荧光逐渐减弱，说明HK2从线粒体上脱落至细胞质中，HK2丧失活性，有氧糖酵解被抑制，推测Bd可能是通过抑制有氧糖酵解而发挥抗肝癌作用，进一步机制正在研究中。

3 结论

以3,4-二甲氧基苯甲醛为原料，以Wittig反应作为关键步骤，通过5步反应合成了3,4-二甲氧基-4′-氯

联苄(Bd)，通过1HNMR、13CNMR和ESI-MS确证了其结构；采用激光共聚焦免疫荧光实验评价了Bd对有氧糖酵解关键限速酶HK2活性的影响。结果显示，在HepG2细胞中，Bd可以促使HK2从线粒体脱落至细胞质中，表明Bd可能通过抑制HK2活性发挥抗肝癌作用。