氧化石墨烯对紫花苜蓿抗病生理生态特征的影响

魏宏达，赵树兰，多立安

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

豆科根瘤能够共生固氮，是全球生物固氮的主体，具有非常重要的生态价值.紫花苜蓿（Medicago sativa）是全世界种植范围最广的一种豆科牧草，具有其他牧草不能比拟的抗逆性强、品质好、产量高、经济价值高等特点.近年来虽然紫花苜蓿的种植面积不断扩大，但病害也经常发生，造成产量和品质下降，甚至会导致家畜中毒.如何更好地进行紫花苜蓿病害防控，增强其抗病性，对于提高紫花苜蓿的产量和品质极为重要.

植物在遭受病原微生物侵害时，自身可通过生理、生化、形态特征等多方面的变化产生抗病性[1].苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶是与植物抗病相关的3种极其重要的酶，可作为植物抗病性的重要生理指标.Duba等[2]研究小麦受病原菌侵染后体内PAL的变化，发现小麦感染病原菌后PAL活性显著升高，抗病能力增强.Wilson等[3]研究也表明，几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶普遍存在于高等植物体内，具有抵抗病原菌侵害的作用.另外，植物体内木质素、富含羟脯氨酸糖蛋白（hydroxyproline-rich glycoprotein，HPRG）及类黄酮等物质也与植物抗病性密切相关.Yao等[4]研究发现，类黄酮可以提高番茄对黄化曲叶病毒的抗性并抑制病毒传播.Deepak等[5]研究发现，木质素和HPRG含量提高可使细胞壁发生木质化，形成物理和化学屏障，增强植物细胞壁抵抗病原菌穿透的能力.

石墨烯（graphene）作为新型碳纳米材料，具有独特的理化特性，在很多领域应用广泛.氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一种石墨烯的重要衍生物，除了具有石墨烯的优良性能外，表面含有较多的含氧基团，使其在环境保护领域也得到了广泛应用[6].另外，GO在治疗肿瘤和中枢神经系统疾病等方面也表现出良好的应用前景[7].然而，GO用量的增加对生物和环境造成的风险也在增加，并引起广泛关注，一些针对GO对植物生长影响的研究已经展开.Begum等[8]研究发现，GO显著抑制了白菜、番茄和红菠菜根、茎的生长，且随着GO浓度的增加，抑制作用增强.Wang等[9]研究也表明高浓度GO显著降低了大豆种子发芽率以及根和幼苗的干质量.但也有报道，GO对番茄种子的萌发具有促进作用，显著提高了种子发芽率[10].可见，GO对植物的影响很大程度上取决于GO浓度和植物种类.植物在生态系统中至关重要，研究GO对植物抗病生理生态特征的影响具有重要意义.

Hu等[11]研究认为，GO对植物的抗病性会产生负面影响.一方面，高浓度GO可对植物造成胁迫，引起植物体的氧化应激反应，致使体内活性氧大量增加；另一方面，GO胁迫会抑制植物抗氧化酶系统对活性氧的清除，过量的活性氧会直接攻击蛋白质和脂质等大分子物质，引起脂质过氧化，造成机体损伤，从而增加植株感染病原菌的风险[12].而有关GO对植物抗病性影响的研究还未见文献报道.本文选取豆科植物紫花苜蓿为研究对象，研究土培条件下GO对紫花苜蓿抗病生理生态特征的影响，为揭示GO存在下豆科植物抗病生理的作用机制提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土壤为天津师范大学校园土，主要理化性质：含水质量分数为16.5%，电导率为1 950μS/cm，速效磷含量为23.2 mg/kg，速效钾含量为473.7 mg/kg，水解氮含量为218 mg/kg，pH值为7.14.紫花苜蓿种子购自于天津市曹庄花卉市场.氧化石墨烯购自于苏州恒球石墨科技有限公司，厚度为3.5～7.0 nm，片层直径为10～50μm，比表面积为100～300 m2/g.

1.2 研究方法

1.2.1 植株培养

采用高18 cm、上直径20 cm、下直径15 cm的花盆为培养容器.每盆装土2.3 kg，GO分别按照0.2%、0.4%和0.6%的质量分数添加，与土壤充分混匀.以不添加GO为对照（CK），每个处理重复4次.每盆中播种150粒大小均一且籽粒饱满的紫花苜蓿种子.花盆随机排列，经常移动位置以保证光照一致，培养期间按需补充水分.实验期间环境温度为14～25℃，相对湿度为15%～30%，光照为自然入射光.种子萌发后60 d测定相关指标.

1.2.2 株高、根长、地上生物量和根瘤数量的测定

选取长势良好、均匀的植株，用直尺测量株高和根长.将收获的植物地上部分用蒸馏水洗净并用滤纸吸水后，在108℃下杀青20 min，80℃下烘干至恒重，称量.采用计数法测定根瘤数量.

1.2.3 抗病相关酶活性的测定

参照Lister等[13]的方法测定PAL活性.取新鲜叶片1.0 g，加入聚乙烯吡咯烷酮0.1 g、5 mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液5 mL和少量石英砂，在冰浴下研磨成浆，4℃下8 000 r/min离心15 min.取上清液0.1 mL，加入3 mL浓度为0.02 mol/L的苯丙氨酸硼酸缓冲液（pH值为8.8），加蒸馏水至6 mL，30℃保温30 min.对照组以蒸馏水为底物.使用紫外分光光度计（UV-1700，Shimadzu，日本）测定290 nm处的OD值.以每分钟OD值变化0.01为1个酶活单位.

几丁质酶活性测定参照Nguyen等[14]的方法并加以改进.取叶片0.4 g，加入0.1 mol/L的乙酸缓冲液（pH值为5.0）2 mL和少量石英砂，在冰浴下研磨成匀浆，4℃下12 000 r/min离心20 min.取上清液0.8 mL，加入0.2 mL胶态几丁质，40℃水浴60 min后，加入0.3 mL的DNS，于沸水浴中显色10 min.静置冷却至室温，再加入2 mL蒸馏水，用紫外分光光度计在540 nm下测定OD值，以零反应时间作对照，以每分钟产生1μmol还原糖所需酶量为1个酶活单位.

β-1，3-葡聚糖酶活性测定参照Kauffmann等[15]的方法.取0.2 g叶片，加入0.1 mol/L的乙酸缓冲液（pH值为5.0）2 mL，4℃下研磨成匀浆，10 000 r/min下离心10 min.两次离心后，取1.0 mL上清液，加入1.0 mL昆布多糖溶液，在40℃下水浴30 min，沸水浴10 min后立即冷却.与2.0 mL的DNS溶液混匀，用紫外分光光度计在550 nm下测定OD值.以每分钟还原昆布多糖释放出1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位.

1.2.4 抗病相关物质含量的测定

参照Pirie等[16]的方法测定类黄酮含量.取叶片0.5 g，加入1%的HCl-甲醇溶液5 mL，在4℃下提取24 h.取0.5 mL提取液，用1%的HCl-甲醇溶液稀释至10 mL，在325 nm下测定OD值，类黄酮含量用每克鲜质量下芦丁的质量（单位为mg）表示.

参照Reddy等[17]的方法并稍作改进测定木质素含量.取叶片0.2 g，加入95%的乙醇3 mL，研磨成匀浆，于5 000 r/min下离心10 min.取出沉淀物，分别用正己烷和95%乙醇冲洗若干次，待沉淀物自然风干后，加入25%的溴乙酰-冰醋酸，65℃下水浴40 min，加入2 mol/L的氢氧化钠0.9 mL和5 mL冰醋酸，1 000 r/min下离心10 min，用紫外分光光度计测定上清液280 nm处的OD值，以每克鲜质量的吸收值表示木质素含量.

参照Kivirikko等[18]的方法测定HRGP.细胞壁中的羟脯氨酸含量与HRGP含量呈正相关，因此，计算出羟脯氨酸的质量即可计算样品中HRGP的质量分数.

1.3 数据处理与分析

采用SPSS19.0软件对所得数据进行单因素方差分析，采用Duncan法在P=0.05水平进行差异统计学意义检验，采用Origin 2017软件绘图.

2 结果与分析

2.1 GO对紫花苜蓿株高、根长和地上干质量的影响

不同质量分数的GO处理下，紫花苜蓿株高、根长和地上干质量如图1所示.由图1可以看出，随着GO质量分数的增加，紫花苜蓿地上干质量和株高均呈现降低的趋势.0.2%GO处理下，紫花苜蓿的株高较对照组有所降低，差异不显著（P＞0.05），地上干质量较对照组显著降低（P＜0.05）.0.4%和0.6%GO处理组中，紫花苜蓿的株高和地上干质量均显著低于对照组，且GO质量分数越大苜蓿生长状况越差.GO质量分数为0.6%时，地上干质量和株高较对照组分别降低了26.7%和20.3%.GO对紫花苜蓿根长没有显著影响.

图1 不同质量分数GO处理下紫花苜蓿的株高、根长和地上干质量Fig.1 Plant height，root length and shoot dry weight of M.sativa under different mass fraction of GO

2.2 GO对紫花苜蓿根瘤数的影响

添加不同质量的GO后，紫花苜蓿单株根瘤数变化如图2所示.由图2可以看出，随着GO质量分数的增加，紫花苜蓿单株根瘤数下降，0.6%GO处理显著抑制了根瘤数的增加（P＜0.05），抑制率为22.3%；0.2%和0.4%GO处理对根瘤数的影响不显著.

图2 不同质量分数GO处理下紫花苜蓿根瘤数Fig.2 Number of nodules of M.sativa under different mass fraction of GO

2.3 GO对紫花苜蓿抗病酶活性的影响

土壤中添加GO后，紫花苜蓿抗病酶活性变化如图3所示.

图3 不同质量分数GO处理下紫花苜蓿的抗病酶活性Fig.3 Disease resistance enzyme activity of M.sativa under different mass fraction of GO

由图3可以看出，PAL活性随GO质量分数的增加而降低，0.4%和0.6%处理出现了显著的抑制作用（P＜0.05），抑制率分别为39.6%和65.7%；0.2%处理与对照组差异不显著（P＞0.05）.GO抑制了几丁质酶的活性，随着GO质量分数的增加，抑制作用增强；0.2%和0.4%处理几丁质酶活性抑制率分别为11.5%和38.1%，与对照组差异不显著（P＞0.05），0.6%处理出现显著抑制作用，抑制率为64.3%.GO对紫花苜蓿体内的β-1，3-葡聚糖酶活性没有显著影响.

2.4 GO对紫花苜蓿抗病物质含量的影响

土壤中添加GO后，紫花苜蓿抗病物质含量的变化如图4所示.

图4 不同质量分数GO处理下紫花苜蓿的抗病物质含量Fig.4 Content of other disease-resistant substances in M.sativa under different mass fraction of GO

由图4可以看出，木质素含量随着GO质量分数的增加而降低，0.4%和0.6%处理出现了显著抑制作用，抑制率分别为31%和45.8%（P＜0.05）.GO对类黄酮含量没有显著影响，但显著降低了HRGP含量，各处理组与对照组相比分别降低了12.6%、36.1%和47.9%.

3 讨论与结论

PAL是植物体内苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶，其活性与植物抗病性密切相关.Solekha等[19]研究发现，水稻感染稻瘟病菌后抗病品种中PAL的活性显著高于敏感品种的活性.本研究结果显示，紫花苜蓿中PAL活性随着土壤中GO质量分数的增加而降低，并且在高质量分数GO处理组中显著降低，表明GO能够抑制PAL的活性，且随着GO质量分数的增加抑制作用增强.PAL活性的高低通常表示PAL基因表达量的多少，即PAL基因表达受到抑制PAL活性将会降低.Wang等[20]研究发现，GO能够导致拟南芥根系发育相关基因表达下调.因此，可以推测GO抑制了PAL基因的表达从而导致PAL活性降低.木质素作为苯丙烷代谢途径合成的重要次生代谢产物，在植物抵御病原微生物入侵的抗病反应中发挥着重要作用.本研究发现，GO处理降低了紫花苜蓿细胞壁的木质素含量，且随着GO添加量的增加，木质素含量和PAL活性的变化趋势完全一致，在高质量分数GO处理下二者均受到显著抑制作用.Shalitin等[21]研究百日草中苯丙烷类代谢酶与木质素的关系，发现百日草细胞分化过程中，木质素的合成与PAL活性增加呈正相关.Kováˇcik等[22]用PAL活性抑制剂氨基茚磷酸（AIP）处理铝胁迫下的母菊，发现其细胞壁木质素的含量显著降低，这和本研究结果相一致.木质素含量的降低可能是由于GO下调了PAL基因的表达，从而抑制了PAL活性，致使苯丙烷代谢合成途径受阻.类黄酮是一类重要的多酚类次生代谢物，具有抗疫酶活性，能够显著降低多种植物的发病率.类黄酮的合成途径受PAL的间接调控，有研究证实两者具有协同增减的趋势[23].本研究发现，GO处理没有显著影响紫花苜蓿的类黄酮含量，类黄酮含量和PAL活性变化趋势不同，两者并没有表现出一定的协同性，这与前人的研究结果有所不同.可能原因有两方面：一是类黄酮的合成途径不仅受PAL的间接调控，还受外界因素和其他相关酶的直接调控，GO抑制了PAL活性，但对其他直接调控类黄酮合成途径的相关酶未造成显著影响，因此并没有引起类黄酮含量的变化；二是木质素合成受到抑制，导致代谢物改变方向进入类黄酮，引起类黄酮物质的增加，而这些增加的量可能恰好弥补了因GO抑制PAL活性导致类黄酮减少的量，因而类黄酮含量没有发生变化.

HRGP是高等植物细胞壁中的一种特殊结构蛋白，可作为木质素沉积位点，增强细胞壁木质化程度，构成紧密的物理屏障阻止病原菌的穿透侵染.本研究结果显示，在所设质量分数范围内GO处理紫花苜蓿后HRGP含量显著下降，表明GO抑制了HRGP合成，对紫花苜蓿细胞壁造成损伤.植物受到胁迫时通常伴随着乙烯浓度的升高，乙烯对植物次生代谢产物的调控具有浓度依赖性，一定浓度的乙烯可以促进某些次生代谢产物的合成，高浓度的乙烯则会抑制次生代谢产物形成[24].本研究中，GO处理对紫花苜蓿株高和地上生物量具有显著抑制作用，表明紫花苜蓿受到了GO的严重胁迫，这与Liu等[25]在水稻中的研究结果一致.因此推测紫花苜蓿中HRGP含量的降低可能是由GO对紫花苜蓿造成胁迫引起乙烯浓度不断升高所致.

几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶在高等植物体内普遍存在，正常情况下在植物体内保持较低的浓度水平.几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶可通过多种诱导因子诱导产生，能够破坏真菌细胞壁上的几丁质和β-1，3-葡聚糖，直接杀死病原菌，被认为是植物诱导抗病的生理机制之一.Li等[26]用枯萎病菌诱导黄瓜时发现，几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性越高黄瓜品种的抗病性越强.本研究中，GO处理降低了紫花苜蓿体内几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性，高浓度GO处理显著抑制了几丁质酶活性，表明GO胁迫严重破坏了紫花苜蓿自身防御系统.GO上的含氧基团能够与酶分子发生静电相互作用，在不使酶变性的情况下显著抑制α-糜蛋白酶（ChT）活性[27].另外，GO可以改变辣根过氧化物酶的结构，从而引起酶活性、动力学常数和酶效率的降低[28].以上研究结果均是通过体外酶活测试所得，而本研究中GO处理使得紫花苜蓿体内2种抗病酶活性降低，GO可能通过植物胞壁进入细胞，引起几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶失活，从而导致酶活性的降低，但有关GO在体内降低酶活性的作用机理尚不明确，有待进一步研究.

综上所述，GO添加到土壤中能够抑制紫花苜蓿的生长，降低其体内PAL、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，对植物防御系统造成负面影响，且随着添加量的增加抑制作用增强.GO显著降低了紫花苜蓿细胞壁HRGP含量，0.4%GO和0.6%GO显著降低了木质素含量，破坏了植物抵御病原菌的屏障.因此，在GO应用过程中，应该注意其可能使植物抗病能力降低的风险.另外，基于本研究所得结果，在进一步的研究中应进行紫花苜蓿病原菌侵染实验，探究GO在紫花苜蓿抵御病原菌侵染过程中对其抗病性及生理机制的影响.