小麦Brock抗白粉菌侵染早期防御应答基因分析

张露露，卞云迪，张 驰，刘晓颖，范宝莉，王振英

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

由禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminisf.sp.tritici（Bgt））引起的小麦白粉病常发生于多雨、潮湿地区，病菌多侵染小麦的叶片、叶鞘等部位，影响小麦生长发育，严重时可导致减产13%～34%[1].小麦受到病原体侵害后，会立即启动抗病基因进行防御反应.在流行病害初期，植物抗病基因诱导产生的抗性可以有效减缓病害的发展进程，随着病原菌最适生长温度、湿度等环境条件的改变，病原菌增殖受到抑制，最终避免病害发生.因此，分析小麦在白粉菌侵染早期的基因表达模式对于探究小麦抗病机理具有重要意义.

Brock是一个强抗白粉病小麦品种，李根桥等[2]研究发现，该品种携带Pm2基因.Pm2是位于小麦5DS染色体上的一个编码NBS-LRR结构的抗病蛋白基因[3].本课题组前期分别在抗病亲本Brock、感病亲本京411及其抗病近等基因系BJ-1中扩增Pm2基因的cDNA序列，最终只在Brock中扩增到该基因cDNA序列，而京411和BJ-1中没有扩增到该基因，因此推测抗病近等基因系BJ-1中的抗性不是来自Pm2，Brock作为BJ-1的抗源供体，至少还含有一个Pm2以外的抗病基因[4].Carver等[5]利用白粉菌孢子侵染大麦时发现，侵染20 s内就可检测到白粉菌孢子所释放的细胞外基质（ECM）.Klement等[6]研究发现，假单胞菌能够在短时间内诱导烟草细胞发生超敏反应.Both等[7]发现，小麦白粉菌病原体侵染30 min到5 d内小麦中会出现一些与初级代谢产物相关的酶.这些结果均表明，病原菌与宿主细胞的互作发生在接种后的1 h内.本课题组前期的研究工作中，比较了抗病品种Brock、感病品种京411以及它们的抗病近等基因系BJ-1在白粉菌胁迫下的早期应答模式，发现抗病品种Brock和抗病近等基因系BJ-1均在2 hpi（hours post inoculation）对白粉菌做出应答反应[8-9]，说明小麦在白粉菌侵染早期就已开始启动防御反应.在小麦与病原菌互作应答的研究中，虽已鉴定出许多差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），但对于早期防御应答中的差异表达基因以及由这些基因构建的不同抗病信号途径还需要进一步探究.

本研究利用高通量RNA-seq技术鉴定了白粉菌胁迫下抗病品种小麦Brock中2～8 hpi的差异表达基因，并分析了抗病相关基因的表达模式.这将为深入探究白粉菌侵染早期的小麦抗白粉病模式提供实验基础.

1 材料和方法

1.1 材料

抗白粉病小麦品种Brock，英国引进.白粉菌生理小种E09，由中国农业科学院植物保护研究所提供.

实验所用引物如表1所示，由苏州金唯智生物科技有限公司合成.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 转录组测序样品的制备及文库构建

待小麦生长至一心一叶期接种白粉菌E09.分别在0、2、4和8 hpi，剪下相同部位的小麦叶片，分别提取叶片总RNA.提取步骤按照植物RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司）说明书进行.将2、4和8 hpi的小麦叶片总RNA样品等量混合作为实验组文库（BMI），以0 hpi的叶片总RNA作为对照组文库（BCI），2组样品处理各设置2个重复，共4个文库.RNA-seq文库的构建和转录组分析工作由诺禾致源生物技术有限公司完成.所有RNA-seq数据已上传至NIH Short Read Archive数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），登录号为PRJNA480377.

1.2.2 数据处理和差异表达分析

从Ensembl（ftp：//ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-35/fasta/triticum_aestivum/dna/）下载小麦参考基因组信息.使用DESeq R软件（1.18.0）对2个处理（每个处理设置2个生物学重复）进行差异表达分析，并设置经校正后的P值＜0.05时为差异表达基因.

1.2.3 差异表达基因的GO和KEGG富集分析

利用GOseq R package（1.18.0）对差异表达基因进行GO（gene ontology）分类，并对基因长度偏差进行校正.利用KOBAS software在KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库（http：//www.genome.jp/kegg/）中对差异表达基因进行KEGG通路富集分析.GO和KEGG富集分析中，经校正后的P值＜0.05时被认为显著富集.

1.2.4 qRT-PCR验证

Brock幼苗长至一叶一心期时，按照1.2.1方法接种白粉菌并分别对0、2、4和8 hpi的叶片进行取材.按照1.2.1中的方法制备小麦RNA，并利用M-MLV Reverse Transcriptase（美国Promega公司）反转录为cDNA，同时根据cDNA非保守区域序列设计引物，如表1所示.根据Fast Start Universal SYBR Green Master mix（美国Roche公司）说明配制PCR反应体系：SYBR Green Mix 10μL，cDNA 1μL，F 1μL，R 1μL，ddH2O 7μL.利用ABI 7500型定量PCR仪（美国ABI公司）进行扩增，扩增体系为：50℃2 min；95℃10 min，95℃15 s，58℃30 s，40个循环.反应完成后进行溶解曲线分析，以确定引物的特异性.每个qRT-PCR测定设置3个重复.使用小麦Actin基因作为内参基因，并通过2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平.

2 结果与分析

2.1 白粉菌胁迫下Brock小麦转录组测序分析

转录组测序结果显示，小麦BMI组的平均clean reads数据量为61.61 M，BCI组的平均clean reads数据量为57.50 M.Q20（%）均大于96%，且只存在＜1%的错误，说明测序结果良好，如表2所示.将获得的转录组数据与小麦参考基因组序列（Ensembl Genomes release-35）进行对比，结果显示每个文库中约有91%的reads都能与参考基因组比对，且与参考基因组有唯一比对位置的reads大约为86%.以上结果证明测序数据可信，可用于后续分析.统计FPKM＞1的转录本数据，构建维恩图和火山图分析两组之间的差异基因，结果如图1所示.BCI组样品中，FPKM＞1的转录本数量为45 195，BMI组为47 963.此外，从BCI和BMI样品中检测到unigenes分别为3 064条和5 832条.以P＜0.05、|log2（fold change）|＞|1|为条件进行DEGs的筛选分析，BMI vs.BCI共有4 625个差异表达基因，其中1 511个被上调，3 114个被下调，如图1（b）所示.

表2 转录组测序数据统计Tab.2 Summary for the transcriptome sequencing and assembly

图1 差异表达基因韦恩图和火山图Fig.1 Venn diagram and volcano map of differentially expressed genes

2.2 差异表达基因的功能注释

为了探究白粉菌胁迫下小麦中的抗病基因表达模式，对差异表达基因进行了KEGG通路分析，富集结果如表3和图2中所示.在BMI与BCI的比较中，上调转录本主要富集在亚麻油酸代谢、α-亚麻酸代谢和玉米素生物合成途径，而下调转录本中显著富集苯丙氨酸代谢、脂肪酸链伸长和植物-病原体互作通路.另外，在一组热图分析中显示了白粉菌胁迫下主要参与基因的表达水平，例如植物-病原体互作通路和植物激素信号途径等，如图2所示.

表3 KEGG富集分析Tab.3 Statistical enrichment analysis for KEGG pathways

图2 差异表达基因热图分析Fig.2 Heatmaps analysis of a group of differentially expressed genes

根据KEGG和热图分析结果，利用qRT-PCR检测不同通路中的9个差异表达基因的表达模式：来自植物-病原体互作途径中的4个DEGs，分别为PR1（pathogenesis-related proteins 1）、WRKY33（WRKYtranscription factor33）、RPM1（resistance to pseudomonas syringae pv.maculicola 1）和RIN4（RPM1 interacting protein 4）；1个参与黄酮和黄酮醇的生物合成途径的基因FOM1（flavone O-methyltransferase l）；1个参与脂肪酸的生物合成和伸长基因LCACS4（long chain acyl CoA synthetase 4）；2个参与植物激素信号的传导基因NPR1和NPR2（nonexpressor of pathogenesis-related gene 1 and 2）；1个编码转运蛋白基因ABCC10（ABC transporter family C10）.接种白粉菌后，WRKY33、RPM1、RIN4、FOM1、LCACS4、NPR1和NPR2共7种DEGs的表达水平出现不同程度的降低，只有PR1和ABCC10的表达水平被上调，如图3所示.

图3 差异表达基因的表达模式分析Fig.3 Analysis of expression patterns of differentially expressed genes

2.3 RPM1和RIN4的表达模式分析

本研究中，病程相关蛋白PR1在2 hpi上调表达，为本底表达的8倍，说明由病原微生物触发的免疫反应已经开始；而抗病基因RPM1在初期2～8 hpi内表达下调，且与之互作的RIN4表达在2～4 hpi下调，到8 hpi恢复到本底表达水平.为了进一步分析RPM1和RIN4在小麦抗白粉病应答反应初期的关联，对抗病小麦Brock中RPM1和RIN4在0～72 hpi的表达趋势进行检测，发现RPM1的相对表达量在2 hpi降低，在12 hpi增加，在24 hpi达到最大，如图4（a）所示，即为本底表达的2.3倍，随后略有下降，到72 hpi时仍高于本底表达，约为1.8倍.而RIN4表达量虽然在24 hpi时略有升高，在2 hpi也略有降低，但总体趋势变化不明显，均徘徊在本底水平，如图4（b）所示.

图4 白粉菌侵染0～72 h RPM1和RIN4的表达模式分析Fig.4 Expression of RPM1 and RIN4 under powdery mildew stress at 0-72 hours post inoculation

3 讨论与结论

3.1 早期抗病防御应答在植物抵御病原菌侵染中发挥重要作用

小麦白粉病是由布氏白粉菌侵染引起的真菌病害.白粉菌孢子接触到介质后，20 s内产生细胞外基质（ECM），有助于白粉菌孢子附着到介质表面，激发植物表面防卫反应信号系统工作[5，7].ECM发挥作用的时间为12 hpi左右，之后ECM便降解.在8 hpi后，小麦叶片表面会有附着胞形成，15 hpi后，附着胞下开始形成侵入钉，在表皮细胞形成初生吸器[7].因此，8～15 hpi应该是白粉菌成功侵染小麦的关键阶段.在本课题组早期研究中克隆得到了一个早期应答基因TaCOI1，并发现在2 hpi时该基因即在抗性小麦品种Brock中开始表达，且在抗病小麦中的基因应答速率明显快于感病材料[8-9].由此说明小麦在病原菌侵染早期就已开始应答，故而探究植物与病原菌互作的早期应答网络对了解小麦抗病机理具有重要意义.本研究对抗白粉病小麦品种Brock的早期应答基因进行了转录组测序，共鉴定出4 625个差异表达基因，分属小麦与白粉菌互作应答的20条主要途径.在已经公布的中国春小麦基因组序列中，Pm2基因的同源序列编号为TraesCS5D01G044600.1（TRIAE_CS42_5DS_TGACv1_457363_AA1485540.1）.对本研究鉴定出的差异表达基因进行分析，结果发现，白粉菌侵染早期，TraesCS5-D01G044600.1的表达量没有发生显著变化.因此认为在白粉菌侵染早期（8 hpi以内），Brock中Pm2基因对白粉菌侵染应答不明显.Brock可能通过其他的抗病基因或抗病反应通路发挥作用.

通过qRT-PCR技术检测了来自不同途径的9种DEGs的转录水平，发现在8 hpi之前，大部分基因表达下调，只有编码病原菌与小麦互作蛋白的PR1和ABCC10基因的转录水平上调.说明来自不同途径的多个基因均参与小麦与病原菌的早期互作反应，但病原菌侵染早期大多数基因首先被抑制表达.

3.2 早期抗病应答中的PTI和ETI响应时间

植物在遭受病原菌侵害时，为了保证自身的正常生长发育，逐渐进化出一套有序的分子调控机制[10].第一类是类受体激酶或类受体蛋白识别受体（RPPs）识别微生物/病原菌相关的分子模式（MAMPs/PAMPs）触发的免疫反应（MTI/PTI）[11-12].PR1基因是PTI反应过程的一个标志性基因，PR1表达上调，意味着PTI被激活[13].为了进一步抵御亲和性病原菌，植物逐渐进化出第二层防御屏障，称为效应子触发的免疫反应（ETI）[14].植物ETI过程主要依赖于抗病（R）基因产物，如RPM1[15]、MLA[16]等NBS-LRR类[17]基因.有报道RIN4作为植物基础防御的调节剂，既可以调控PR1表达，也可以通过AvrRpm1和AvrB激活RPM1介导的植物抗性[18].

本研究发现在接种白粉菌2 hpi后，PR1的表达量平均增加了8倍，说明由病原微生物触发的免疫反应在2 hpi就做出应答.抗病基因RPM1在接种白粉菌初期表达下调，12 hpi才开始增加，此后一直维持高水平表达.Wu等[19]在研究由Lr47介导的小麦抗叶锈病基因表达网络中发现，TaPR1（GenBank NO.FJ815169.1）和TaRPM1（RPM1-AA1836940）基因的表达高峰分别发生在48 hpi和72 hpi.虽然总体趋势相似，但本研究发现PR1和RPM1基因对白粉菌侵染的响应时间更早，分别为2 hpi和12 hpi，而RPM1的互作基因RIN4的表达量在0～72 hpi虽有变化，但不显著，进一步说明RIN4作为“卫兵分子”，并不直接参与抗病反应，而是通过病原菌分泌蛋白，调节RPM1产生抗性[18，20].综上，在小麦抗白粉病防御反应初期，PTI早在2 hpi就被触发，ETI在12 hpi也开始响应，植物PTI和ETI协同作用抵抗白粉菌早期侵染.本研究结果为揭示小麦-白粉菌早期互作机制提供了新的实验依据.