水稻早抽穗突变体zc1的表型分析及候选基因鉴定

郝宏姣，王 鑫，田 瑶，兰志鹏，周诗晨，刘晓男，郑 瑞，王馨翊，张泗举，栾维江

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

开花是植物由营养生长阶段向生殖生长阶段转变的重要过程.植物开花的时间主要受外界环境因素以及植物自身内源基因网络调控的影响.外界环境因素包括温度、光照、营养等，其中最主要的就是日照长度，即光周期现象.光周期现象是植物对于长短日照信号的不同反应.根据光周期对植物产生的不同影响可以将植物分为短日照植物（水稻、大豆等）、长日照植物（小麦、拟南芥、短柄草、向日葵等）和日中性植物（棉花、月季等）[1-2].水稻作为一种主要的粮食作物，其产量受到开花时间的影响.水稻先抽穗再开花，因而其抽穗期决定了开花期.水稻是一种兼性短日照植物，短日照促进抽穗；长日照下水稻抽穗延迟，但仍可抽穗.最近20年来，在水稻中鉴定出了一系列花期调控相关基因，其中最重要的是成花素基因.成花素是一类小分子球状蛋白，在叶片中合成，之后通过茎的韧皮部转运到茎顶端分生组织，促进开花[3-4].成花素基因的表达受到一系列基因的调控，初步形成了基因调控网络.短日照和长日照下的调控网络既有联系又有不同[5]，共同解释了为什么水稻在短日照条件下提早开花，而在长日照条件下延迟开花.

在短日照条件下，成花素基因Hd3a受到其上游Hd1基因和Ehd1基因的正向调控在叶片中高表达[6-7]，所编码的蛋白从茎的韧皮部转运到茎顶端分生组织细胞中，与其受体14-3-3类蛋白及bZIP类转录因子OsFD1结合形成成花素激活复合体（florigen activation complex，FAC），进一步促进成花素下游成花身份基因OsMADS14/OsMADS15的转录[3-4]，从而促进水稻在短日照条件下开花.在该调控通路中，Hd1编码一种锌指蛋白，与拟南芥COSTANS基因同源，在短日照条件下可以促进Hd3a基因的表达[8].Ehd1编码一个B型应答效应因子，它是水稻中特有的调节因子[9]，可以独立于Hd1基因促进Hd3a基因的表达.另外，节律钟基因OsGI编码一个含有跨膜结构域的蛋白质，位于调控通路的上游，可以正向调控Hd1基因和Ehd1基因的表达[9-10].在长日照条件下，Hd1基因功能发生了逆转，抑制成花素基因Hd3a的表达，从而抑制其下游成花身份基因OsMADS14/OsMADS15的表达而延迟水稻抽穗.Hd1功能逆转需要Ghd7基因和DTH8基因的存在.Ghd7编码一个含有CCT结构域的蛋白质，在长日照下高表达，抑制其下游Ehd1的表达，从而抑制下游成花素Hd3a表达，延迟水稻在长日照条件下的抽穗[11].DTH8/Ghd8编码一个HAP3亚家族的转录因子，通过与Hd1和Ghd7形成复合体，抑制Hd3a的表达[12].

虽然目前已经初步建立了水稻开花基因调控网络，但该网络仍不完善，有待发掘和鉴定更多的调控基因.因此，筛选抽穗期突变体以及鉴定更多的开花调控基因，对完善水稻开花调控网络和解析开花控制机制有着重要的理论意义和应用价值.本课题组前期从转基因水稻株系中发现了一个早抽穗突变体，在长日照和短日照条件下均表现出早抽穗并可以稳定遗传.为了克隆突变基因，本研究对突变体株系进行了遗传分析，利用热不对称交错PCR技术（Tail-PCR），扩增了T-DNA的侧翼序列，克隆了候选基因.

1 材料与方法

1.1 实验材料

粳稻品种中花11（Oryza sativaL.ssp.Japonicacv.ZH11）及早抽穗突变体株系（zc1），均种植于天津师范大学试验田，保持田间常规管理.

1.2 实验方法

1.2.1 突变体的鉴定与遗传分析

种植野生型水稻中花11和转基因株系，在水稻生殖生长阶段记录其抽穗期并拍照.同时单株提取野生型及转基因植株的基因组DNA，利用T-DNA上的特异基因引物进行PCR扩增，以确定其是否携带有T-DNA.

1.2.2 T-DNA侧翼序列的扩增

采用文献[13-14]中的Tail-PCR技术进行T-DNA侧翼序列扩增.根据序列中的右边界（right border，RB）端序列，由内向外设计3条嵌套引物，即RB-0b、RB-1b和RB-2b，分别与4条简并引物（LAD1-1～LAD1-4）组合，进行PCR反应.整个过程共有3轮PCR，采用文献[13-14]中的扩增体系，引物序列如表1所示.

表1 用于Tail-PCR的引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences used for Tail-PCR

3轮PCR扩增完成后，用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离.选择第3轮扩增产物中的特异性条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序.

1.2.3 侧翼序列的比对分析与插入位点的确定

将测序结果首先与T-DNA序列进行比对，去除T-DNA的边界序列.然后将剩余侧翼序列在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行同源性比较，得到其同源序列.将同源序列在水稻基因组注释网站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）进行比对分析，得到侧翼序列所属的基因位点和座位号，从而确定TDNA的插入位点.

1.2.4 突变体的分子鉴定

根据突变体中T-DNA插入位点设计基因特异的引物ZC1-F1和ZC1-R1，与T-DNA上右端边界引物RB-2b组合，对T-DNA插入株系中所有单株进行PCR扩增，以检测是否携带T-DNA以及是纯合还是杂合状态.如果单株为野生型，则只能用引物ZC1-F1和ZC1-R1扩增得到基因特异的条带；如果单株为T-DNA插入纯合体，则只能用引物ZC1-F1和RB-2b扩增得到基因序列与T-DNA序列的融合片段；如果单株为TDNA插入杂合体，则可以扩增出以上2种片段.

PCR反应总体系为25.0μL：Q5 High-Fidelity 2×Master Mix 12.5μL，引物ZC1-F1、ZC1-R1、RB-2b各1.25μL，模板DNA 1.0μL，水7.75μL.PCR反应程序为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s；58℃复性30 s；72℃延伸30 s；共35个循环；72℃延伸2 min.PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测.

2 结果与分析

2.1 早抽穗突变体zc1的表型鉴定与遗传分析

种植突变体株系，发现突变体株系产生了表型分离，如图1（a）所示.30个单株中，8株抽穗较早且株高较低，与野生型中花11相比抽穗期提前18 d左右；另外22株的抽穗期和株高与野生型中花11相比没有明显差异，将这些早抽穗植株命名为zc1（zaochou1）.正常抽穗植株与早抽穗植株的分离比为22/8，推测早抽穗可能是单基因控制的隐性性状.χ2符合度测验结果表明，该比例符合3∶1的孟德尔分离比（χ2=0.05，P＞0.05）.由于水稻的抽穗期和日照长度有关，为了分析该株系在短日照下的表型，又将该株系种植在自然短日照条件下，发现其抽穗期依然发生分离（早抽穗6株/正常抽穗20株），突变体zc1比野生型中花11早抽穗10 d，如图1（b）所示.上述结果表明，zc1在长日照和短日照条件下均呈现早抽穗表型.

图1 zc1的早抽穗表型和抽穗期分析Fig.1 Phenotype and heading-date analysis of zc1

2.2 早抽穗表型与T-DNA共分离分析

由于早抽穗表型株系来源于转基因材料，因此首先需要确认该表型是否与T-DNA的插入有关.提取所有30个单株的基因组DNA作为模版，对T-DNA中的潮霉素磷酸转移酶基因（Hyg）片段进行PCR扩增，结果如图2所示.

由图2可以看出，在所有的8个早抽穗单株中，都扩增出了目的条带；在正常抽穗的22个单株中，15株扩增出目的条带，7株未扩增出目的条带.说明这15株扩增出目的条带的正常抽穗植株中可能是TDNA杂合插入的，其中一条同源染色体上有T-DNA插入，而另一条同源染色体上没有T-DNA插入.7株未扩增出目的条带的正常抽穗植株是纯合野生型.此外，Hyg标记基因片段有无的分离比率符合3∶1，符合一对显隐性基因的分离比，说明T-DNA以单拷贝的方式插入到水稻染色体中，如表2所示.上述实验结果表明，早抽穗单株都携带T-DNA；而正常抽穗单株中，既有携带T-DNA的单株也有不携带T-DNA的单株.结合早抽穗突变体的遗传分析结果（单基因控制的隐性突变），推断早抽穗表型可能是由于T-DNA插入导致基因失活所致.早抽穗单株可能是T-DNA插入纯合体；正常表型单株中，既有野生型也有T-DNA插入杂合体.

表2 T-DNA标签的卡平方检验Tab.2 Chi-square test for T-DNA tags

2.3 T-DNA侧翼序列的扩增与候选基因的确定

为了鉴定T-DNA序列在水稻染色体上的插入位点，用Tail-PCR方法扩增突变体中T-DNA的侧翼序列.本研究设计了4组简并引物（LAD1-1～LAD1-4），分别与T-DNA序列上的引物（RB-0b、RB-1b、RB-2b）组合，进行了3轮PCR扩增.用琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测，结果如图3所示.

图3 Tail-PCR扩增产物凝胶电泳及测序结果Fig.3 Amplification of Tail-PCR and flanking sequence of T-DNA in zc1 mutant

由图3（a）可以看出，第3轮扩增产物中出现了多个特异条带.回收其中的4个特异性条带，如图3（a）圈中部分所示，进行DNA序列测定.4个片段所得序列具有相似结果，其中一个结果如图3（b）所示.

对所得测序结果除去T-DNA上的侧翼序列之后，在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行blastn比对，结果表明侧翼序列与水稻中一个类受体蛋白激酶LRR-RLK的序列完全一致.从水稻基因组注释网站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）上获得了该序列所在的基因编号及全长，命名为ZC1基因.进一步分析发现，T-DNA插入到ZC1基因第一个外显子的起始密码子ATG后的第233个核苷酸之后，造成了编码框中断，如图4（a）所示.为了进一步确定T-DNA是否确实插入到ZC1基因的第一个外显子上以及携带有T-DNA的单株是否纯合，在插入位点上游设计引物ZC1-F1，在插入位点下游设计引物ZC1-R1，与T-DNA上的RB-2b引物组合，对所有的30个单株基因组DNA进行PCR扩增，结果如图4（b）所示.由图4（b）可以看出，所有突变体单株（m1～m8）只能扩增出引物RB-2b和ZC1-R1之间584 bp条带，说明是T-DNA插入纯合体植株.未携带T-DNA的正常表型单株（n1、n4、n7、n8、n13、n15、n22）只扩增出引物ZC1-F1和ZC1-R1之间的1 235 bp条带，说明是纯合野生型植株.携带T-DNA的正常表型单株（n2、n3、n5、n6、n9～n12、n14、n16～n21）扩增出584 bp和1 235 bp 2个条带，说明是T-DNA插入杂合体植株.该结果与上述标记基因检测结果完全吻合，表明T-DNA确实插入到ZC1基因中.

图4 利用三引物PCR检测T-DNA插入位点纯合性Fig.4 Homozygosity test of T-DNA insertion using tri-primer PCR

3 讨论与结论

突变体是研究基因功能的重要材料，水稻中许多重要的开花调控基因等都是从突变体中克隆的.本研究从转基因材料中鉴定了一个早抽穗突变体，在短日照和长日照下均表现为早抽穗表型.进一步分析发现，所有突变体单株都携带了T-DNA序列，且在整合位点上是纯合的.T-DNA插入造成了富亮氨酸类受体蛋白激酶ZC1基因的编码框中断，导致了后者的功能丧失.

类受体蛋白激酶是生物中一类重要的信号转导蛋白，由胞外受体结构域（extracellular domain）、中间跨膜区（transmembrane domain，TM）以及胞内激酶结构域（cytoplasmic domain）3个基本的结构域构成[15-16].胞内激酶结构域相当保守，主要是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有磷酸化结合位点.类受体蛋白激酶主要通过丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化传递光、病原体侵入、低温、干旱、激素等信号[17-18].位于中间的跨膜区结构域起着连接胞内外信号传递以及将蛋白绑定在膜上的功能，由22～28个氨基酸构成.而胞外区的受体结构域是非保守的，不同类型的类受体蛋白激酶胞外区的氨基酸序列差异很大，用于识别和接收不同的胞外信号[19].越来越多的研究结果表明，类受体蛋白激酶在调控植物生长发育、参与植物对外界刺激的抗性和植物激素信号传递过程中起着重要作用.在水稻中，类受体蛋白激酶参与了花的发育[20]、抗病防御反应[21-22]、非生物胁迫响应[23-24]、激素信号传递[25-26]等过程.预测水稻中有超过1 131个类受体蛋白激酶基因[27]，大多数的功能还没有得到鉴定.已知的水稻抽穗期调控基因中，大多数是转录因子类或者转录调控的协作因子，蛋白激酶类基因鲜见报道，仅有2个编码酪蛋白激酶（casein kinases I and 2α）的基因Hd6和Hd16参与水稻抽穗期调控[28-29].本研究推测类受体蛋白激酶基因ZC1的T-DNA插入突变可能导致了水稻早抽穗表型.下一步将对突变体进行互补实验，并且创制ZC1的等位突变体，进行ZC1的功能验证，确认类受体蛋白激酶基因ZC1是否负责早抽穗表型的变异.