KIF4A尾部结构域与不同结构DNA的相互作用

张壮壮，闫鲁霞，程蓓蓓，朱长军

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室，天津300387；3.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

有丝分裂是真核细胞生长分裂的基本方式，染色体的形成和分离是保证有丝分裂过程中细胞遗传物质稳定性的关键.定位于染色体上的多种蛋白质能够对染色体的形成和分离进行调控，同时还有许多其他因素参与，共同形成一个调节网络，最终保证遗传物质以极高的保真度分配到子细胞中[1-2].有丝分裂期间，遗传物质染色质被压缩凝集成染色体，这涉及一系列蛋白分子的精密调控，如拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，TopoⅡ）会辅助染色体凝集复合物（condensin complexes）生成染色体内部连接[3].部分驱动蛋白也会参与到染色质凝集过程中[4]，如定位到染色体的驱动蛋白KIF4A，因其具有结合染色体的特性，故也被称为染色体驱动蛋白.

驱动蛋白是一类能依赖自身ATP酶活性沿着微管在细胞内运动的蛋白分子[5-6].KIF4A属于驱动蛋白4家族的一员[7]，具有多种功能，包括参与神经细胞的自发性收缩[8]、DNA损伤修复反应[9]、在减数分裂中调控着丝粒与微管的结合[10]以及在有丝分裂中调控染色体的凝集与整列[11].KIF4A的异常表达往往与肿瘤的发生发展、患者的不良预后有关，例如KIF4A在大部分肺癌中高表达[12]，却在非小细胞肺癌细胞A549中低表达[13].且KIF4A的DNA修复功能与非小细胞肺癌的顺铂耐药性有关[14].KIF4A由3个结构域组成：N末端马达结构域（motor domain）、中央螺旋卷曲杆状结构域（coiled-coil stalk）、C末端货物结合结构域（tail region）[15].KIF4A的染色体定位受众多因素的影响，但这些因素的先后顺序与主导因素并不清楚.KIF4A的尾部结构域对于KIF4A的染色体定位发挥了重要作用，现研究证明，KIF4A尾部结构域上存在许多影响其染色体定位的位点，如T1161、S1186、L1214[16-18]等.除此之外，KIF4A尾部结构域上还含有半胱氨酸富集区[19]（cysteinerich motif，CR），具有的半胱氨酸的特性会使其形成含有二硫键的锌指结构，能够识别并结合DNA[20].但KIF4A尾部结构域的CR区调控KIF4A识别结合不同结构DNA的分子作用机制仍不明确.

为了探究体外KIF4A尾部结构域结合DNA的特性，本研究将含有CR区的KIF4A尾部结构域分别与具有线性双螺旋结构和超螺旋结构的质粒共孵育.选择pBluescript-SK（-）质粒，该质粒具有质量小、电泳条带变化明显的特点，且质量不会过小，避免了相同物质的量的条件下因荧光强度过小不利于观察的情况.应用检测分析体外蛋白-DNA结合的凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），对KIF4A尾部与DNA的相互作用进行深入探究.

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

pET-21a（+）质粒、pBluescript-SK（-）质粒、pEGFPKIF4A-WT质粒，实验室自存；大肠杆菌感受态细胞Trans T1，北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌BL21（CE3）感受态细胞，北京索莱宝科技有限公司.

1.2 主要试剂

限制性内切酶Kpn I、EcoR I、Sal I、Xho I，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；2×Taq Master Mix，南京诺唯赞生物技术有限公司；Blue Plus VProtein Marker（10×103～190×103）、ProteinIso Ni-NTRResin，北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、Super DNA Marker、凝胶回收试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；质粒提取试剂盒，凯杰生物科技有限公司；EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5×）、EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色，10×），碧云天生物技术有限公司.

1.3 方法

1.3.1 pET-KIF4A-C278诱导表达质粒的构建

根据编码KIF4A的第954～1 232位氨基酸的基因序列，设计PCR引物（上游引物：5′-CGGAATTCCTTTTCCTTGTCG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAGTGGGCCTC-3′）.以pEGFP-KIF4A-WT质粒为模板进行PCR，得到两端带有EcoR I与Sal I酶切位点的KIF4A-C278的基因序列.用EcoR I酶和Sal I酶进行酶切（37℃水浴，20 h）.将pET-21a（+）质粒用相同的酶进行酶切，用凝胶回收试剂盒回收酶切产物.用T4 DNA连接酶将KIF4A-C278序列连接到pET-21a（+）质粒上，得到的产物全部转化到Trans T1感受态细胞中.用含有氨苄抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆（37℃，过夜培养），所得的单克隆在含有氨苄抗性的LB液体培养基中扩培（37℃，225～250 r/min，过夜培养）.收集过夜培养的菌体进行少量质粒提取，用双酶切进行鉴定.鉴定正确的质粒送到天津金唯智生物公司测序，测序结果与NCBI中的KIF4A序列进行比对.

1.3.2 截短突变体KIF4A-C278蛋白诱导表达

将测序正确的pET-KIF4A-C278质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中，用氨苄抗性的固体LB培养基筛选阳性克隆（37℃，过夜培养）.挑取单克隆，用氨苄抗性的LB液体培养基扩增培养（37℃，225～250 r/min，过夜培养），菌液于4℃保存.取少量菌液再次用含氨苄抗性的LB液体培养基扩培（37℃，225～250 r/min，2 h），取少量菌液制成诱导表达前的样品，剩余菌液加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导质粒表达（37℃，225～250 r/min，2 h），取少量菌液制成诱导表达后的样品.将上述样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将凝胶用考马斯亮蓝染色，用甲醇/冰乙酸脱色.观察诱导后菌体是否有目的蛋白表达.

1.3.3 KIF4A-C278蛋白的纯化

取上述用IPTG诱导成功的诱导前菌液，加入到50 mL含有1 mmol/L的IPTG的LB氨苄抗性液体培养基中诱导表达（37℃，225～250 r/min，2 h）.收集诱导后的菌液，4℃、8 000 r/min条件下离心5 min，收集细菌沉淀，用2 mL裂解液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH值为8.0）和溶菌酶（终质量浓度为10 mg/mL）冰上裂解细菌沉淀30 min，并用超声波充分裂解.4℃、1 000 r/min条件下离心30 min，收集上清，加入0.5 mL的Ni-NTRResin，4℃混匀60 min.用洗液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH值为8.0）洗Ni-NTR Resin，最后用洗脱液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH值为8.0）将蛋白洗脱下来.上述操作过程均留样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测蛋白表达与纯化情况.将最终纯化的蛋白条带与1μg BSA样品条带进行灰度值比较，估算蛋白浓度.纯化的蛋白分装好后用液氮速冻，-80℃条件下保存.

1.3.4 KIF4A-C278蛋白与DNA结合凝胶迁移实验（EMSA）

选取本课题组自存质粒pBluescript-SK（-），该质粒是用QIAGEN质粒提取试剂盒提取并自存，有较完整的环状结构，大小约2 960 bp.将质粒与纯化蛋白以一定的物质的量之比混在一起，在EMSA/Gel-Shift结合缓冲液中于室温（20～25℃）孵育40 min.加入EMSA/Gel-Shift上样缓冲液制样，进行琼脂糖凝胶电泳，并成像观察质粒的滞后情况.

2 结果与分析

2.1 pET-KIF4A-C278质粒构建

KIF4A的结构如图1（a）所示，插入目的片段KIF4AC278为954～1 232 bp的KIF4A尾部结构域.对得到的质粒进行酶切鉴定，结果如图1（b）所示.无论是单酶切还是双酶切，条带大小均正确.酶切鉴定及测序序列比对显示质粒构建成功.

图1 重组质粒的验证Fig.1 Detection of recombinant plasmid

2.2 BL21（DE3）感受态细胞中蛋白诱导表达

将相同细胞量的未诱导菌液与IPTG诱导后的菌液制成样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.用考马斯亮蓝染色，甲醇/冰乙酸脱色液脱色后观察，所得结果如图2所示.由图2可以看出，IPTG诱导后样品在低于40×103条带处有大量目的蛋白表达.证明IPTG诱导成功，且目的蛋白分子质量正确.

图2 IPTG诱导表达KIF4A-C278蛋白Fig.2 IPTG induces the expression of KIF4A-C278 protein

2.3 KIF4A-C278蛋白纯化结果

收集50 mL的IPTG诱导后菌液，高速离心后收集菌体沉淀并用裂解液裂解.裂解液高速离心后收集上清，将上清用Ni-NTR Resin浓缩纯化.用洗液洗Ni-NTR Resin，可以看到洗液中不含目的蛋白.用洗脱液将目的蛋白从Ni-NTR Resin上洗脱下来，可以看到第4次洗脱液中的目的蛋白较为纯净，几乎没有杂带，且含量较高，如图3所示.根据条带的灰度值估测，KIF4A-C278的质量浓度约为0.1μg/μL.

图3 KIF4A-C278蛋白纯化结果Fig.3 Purification results of Protein KIF4A-C278

2.4 蛋白-DNA结合实验结果

为了探究KIF4A-C278蛋白结合DNA的功能，将蛋白与DNA在体外环境下孵育，观察其结合情况.选取分子质量偏小的pBluescript-SK（-）质粒，将KIF4A-C278蛋白与质粒DNA在室温下（20～25℃）孵育40 min.预实验结果显示，质粒与蛋白物质的量之比为1∶1 000时结果较清晰，结果如图4（a）所示.相比于对照组，加入KIF4A-C278蛋白的实验组在大于3 000 bp处发现了较为明显的滞后条带.用Image J进行条带的灰度值分析，用GraphPad Prism8进行数据统计与作图，结果如图4（b）表示，加入KIF4A-C278纯化蛋白后的滞后条带与对照组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）.

图4 蛋白质-DNA结合实验Fig.4 Protein-DNA binding assay

2.5 酶切对照组实验结果

为了探究质粒DNA的结构对KIF4A-C278结合DNA的影响，将质粒用限制性内切酶Kpn I酶切1 h.酶切后的质粒为线性双螺旋DNA，与之前未酶切的超螺旋结构DNA形成对照.此次实验组为酶切后质粒与KIF4A-C278纯化蛋白共孵育，对照组采取了酶切后质粒与无蛋白空白对照组、酶切后质粒与无蛋白洗脱液对照组、酶切后质粒与BSA阴性对照组.除此之外，还加入了前面实验中的未酶切质粒空白对照组.结果如图5所示.由图5可以看出，质粒大小正确（位置低于3 000 bp的条带），且酶切过的线性质粒DNA不能与KIF4A-C278蛋白结合，未形成滞后条带.

图5 蛋白质-线性DNA结合实验Fig.5 Protein-linear DNA binding assay

3 讨论与结论

染色体驱动蛋白分子KIF4A在细胞中具有多个功能，如在DNA复制时稳定基因组、在胞质中运送物质等[21]，其中最主要也是目前最受关注的是KIF4A在有丝分裂尤其是早期的功能.KIF4A在染色体上发挥功能是基于其染色体定位的，此过程受众多因素调节，如染色体凝集素（condensin I）的CAP-G亚基与KIF4A尾部上的Leu1214位点相结合[22]、Aurora A激酶磷酸化调控KIF4A与condensinⅠ的相互作用[23]、Cdk1激酶磷酸化KIF4A尾部的Thr1161位点与Ser1186位点等，这些位点都会影响KIF4A的染色体定位.由此可见，KIF4A的尾部结构对其染色体定位至关重要.但目前并未分析出这些因素中的相互关系与主导因素.现有研究皆为细胞内实验，体外实验暂为空缺.在有丝分裂前期，condensin I定位在核膜上时，KIF4A在核中是如何定位到染色体上的，是否依靠自身的DNA结合结构域尚未明确.为了探究KIF4A尾部结构域能否自主结合DNA以及该过程的影响因素，本研究纯化了KIF4A尾部结构域蛋白，通过用线性双螺旋、超螺旋2种结构的DNA与蛋白质进行共同孵育，发现KIF4A尾部结构域会与超螺旋DNA结合并产生滞后条带，却不结合线性双螺旋DNA.即KIF4A尾部结构域有着自身结合DNA的能力，但并不会时刻表现出来.由于此KIF4A尾部结构域蛋白本身含有结合DNA功能的CR区域以及T1161、S1186、FF1220等调控KIF4A染色体定位的位点，因此推测，KIF4A尾部结构域可能受到某些位点的影响.且KIF4A在细胞内是以二聚体形式行使功能，而构建的蛋白有一小段螺旋卷曲结构域，在体外也有可能会形成二聚体形式.这一结果可能会对KIF4A结合DNA产生影响.基于此可以提出一个模型：KIF4A依靠其尾部结构中的CR结构域识别并结合DNA，其他的位点会对此过程有调控作用.这预示着KIF4A在有丝分裂开始染色质凝缩形成染色体时，可能会依赖于此功能识别并趋向于定位在染色体上.