白芍总苷对母婴分离小鼠行为学与相关脑区小胶质细胞的影响❋

梁 媛， 苗 襄， 高静静， 岳广欣△， 岳利峰

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所， 北京 100700；2.莆田市中医医院，福建 莆田 351100；3.开封市中医院，河南 开封 475000；4.北京中医药大学东直门医院， 北京 100700)

早年不良应激属于慢性心理应激(chronic psychological stress，CPS)的一种，儿童时期受到创伤、虐待和忽视的经历与其成年后罹患精神疾患的风险增加密切相关，且已被证明会导致啮齿类、灵长类动物和人类的各种行为缺陷[1-2]。母婴分离动物模型是早年应激对个体生理、病理造成不良影响的神经生物学机制研究的重要工具。前期工作发现，母婴分离小鼠成年后更容易表现出抑郁、焦虑样行为，如在高架十字迷宫实验开放臂活动减少、强迫游泳与鼠尾悬挂实验中不动时间明显延长等[3-6]，但其具体的作用机制尚不清楚。近年来研究提示，炎症免疫反应参与其中[7]。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，随着对其功能研究的不断深入发现，其在精神障碍类疾患的发病中起着越来越重要作用[8-9]。

白芍( Radix Paeonia Alba) 为毛莨科植物芍药(Paeonialactiflora Pall．)的干燥根，性微寒，味苦酸，归肝、脾经，具有养血敛阴、平抑肝阳、柔肝止痛之功[10]。其有效成分主要是一组苷类，包括芍药苷、白芍苷 R1、芍药新苷、氧化芍药苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等，总称为白芍总苷(total glycosides of paeony ,TGP)[11-12]，并具有补血、降压、抗炎、镇痛等多重药理作用[13-15]。近期有学者发现，TGP在慢性应激小鼠模型中能够发挥一定的抗抑郁作用[16]。本实验建立母婴分离模型小鼠，在其生长至P90～P120时以TGP进行4周的干预，通过旷场及社会交互行为实验观察4周后小鼠行为模式的变化，免疫组织化学方法检测小胶质细胞标志物离子钙接头蛋白 (ionized calcium-binding adaptor molecule，Iba) -1的表达，研究TGP对小胶质细胞功能状态的影响，以期进一步探讨TGP的免疫与抗炎作用及其对早年心理应激造成成年后抑郁易感性的可能作用机制。本研究已通过中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会批准，批准号2019-003。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级C57BL/6J小鼠60只，雌鼠48只，雄鼠12只，体质量19～26 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号SCXK(京)2019-0012，置于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物房常规饲养，室温22 ℃，相对湿度30%～40%，12 h光/暗周期，自由进食和饮水。

1.2 主要药物与试剂

白芍总苷胶囊(规格0.3 g×36粒，批号160803)，朗生医药有限公司；包埋剂(ZLI-9302)，北京中杉金桥生物技术有限公司；TritonX-100(H5142)，Promega；正常兔血清(ZLI-9026)、抗体稀释液(2LI-9029)、兔抗山羊lgG/生物素标记(ZB-2050)，北京中杉金桥生物技术有限公司；Anti-Iba-1antibody(ab5076；abcam)、Elite ABC试剂盒(PK-6100，VECTASTAIN)、DAB(D5637-5G)，sigma公司。

1.3 母婴分离

选用24 g 以上成年C57BL/6J小鼠进行繁殖，将小鼠按雌雄=4∶1雌雄混居，孕鼠待产前单笼饲养，分娩后每窝仔鼠保持在4～7 只，以小鼠出生作为0 天(P0)，分别于P5～P14 进行母婴分离，即先将母鼠移至新笼，再将仔鼠移至孵育箱(32 ℃)，每只仔鼠放在独立的小盒中进行分离，每天分离8 h。

1.4 动物分组及给药

选用出生后P90～P120的 C57BL/6J雄性小鼠进入实验。先将未经过母婴分离且月龄相当的10只小鼠作为正常组，再将经过母婴分离的10只小鼠分成母婴分离组和TGP组8只。参照说明书，TGP的用药量按0.5 mg/10 g体质量计算。每粒胶囊重0.3 g，含104 mg TGP活性成分，1只实验鼠(20 g)1d的用药量为1.0 mg，8只小鼠28 d总用药量224 mg，换算成TGP胶囊即为646 mg。将646 mg TGP胶囊溶于双蒸水中定容至896 ml，按每只小鼠日采食量4 g计算，将896 g粉碎饲料与上述药水混合均匀(药水与饲料=1∶1)。将混合好的饲料用简易面条机压缩成条状，在烤箱中烘烤8 h，干燥冷却后含药饲料即准备就绪。为防止灌胃造成的应激与损耗，TGP组小鼠每天给予一定量的TGP含药饲料进行干预，共喂养28 d。正常组和母婴分离组在此期间分别喂饲正常饲料。

1.5 行为学检测

行为学检测均在药物干预4周后开始，具体操作如下。

1.5.1 旷场实验 小鼠适应实验室15 min后，放入旷场箱(40 cm×40 cm)中心点，设中心点附近20×20 cm区域为中央区，记录30 min小鼠运动总路程(total distance of movement)和中心区活动时间(central area activity time)。

1.5.2 社会交互实验 旷场实验结束后第2天进行社会交互实验步骤如下[17]：①实验鼠放于与原笼一样的鼠笼中适应15 min，实验开始前先将1只同种属同性别的小鼠放置在6×8×10 cm 的金属网笼中，再将金属网笼贴壁放在40×40 cm 的旷场箱的一侧箱壁正中，随即将实验鼠放至旷场箱的对侧箱壁中点，将金属网笼周围25×20 cm区域设置为接触区，接触区对侧的2个13 cm×13 cm角落为远角区，记录5 min 内实验鼠进入接触区的时间；②间隔35 min 后，再将实验鼠放入同样的旷场箱中，接触同一只同性别的接触鼠，再次记录测试实验鼠进入接触区的时间；③进入远角区时间为远角停留时间(distant residence time)，第1 次测试进入接触区时间为训练探查时间(training exploration time),第2 次测试进入接触区时间为辨别探查时间(discrimination exploration time)。

1.6 免疫组化染色

行为学实验结束后，各组小鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射进行深度麻醉(100 mg/kg体质量)，继之用4%多聚甲醛溶液灌注，取脑后固定12 h(4 ℃保存)，置于30%蔗糖溶液中脱水(4 ℃保存)，待组织下沉后恒冷低温切片(30 μm)。切片置于24孔板中平衡30 min，通过漂浮法进行免疫组化染色，用抗体稀释液稀释一抗(Iba-1稀释度为1∶1000)，4 ℃孵育18 h；生物素化的二抗(1∶250)室温摇床孵育4 h；Elite ABC(1:25，用1×PBS稀释)，室温摇床90 min；0.05%DAB显色，以上步骤皆用1×PBS充分漂洗，将切片贴于载玻片上，干燥后脱水、透明、封片、拍摄。选用每组冠状面相似并带有海马的切片，利用AperioCS2数字病理切片扫描系统扫描脑组织切片，用Image Scope在20×放大倍数下截取CA1区、CA3区、下丘脑图像，图像大小为1264×697，每组20张切片，利用image pro Plus 6分析并计算阳性产物的IOD值。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 旷场实验结果

图1示，与正常组比较，母婴分离组小鼠30 min运动总距离明显增加 (P<0.05) ，TGP可明显缩短小鼠的运动总距离(P<0.05)，3组小鼠中心区停留时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A：旷场实验(Open field test)中心区停留时间(time in center zone)，B：旷场实验30 min运动总距离(total distance in 30 min)；结果以表示；NC:对照组，n=10；MS:母婴分离组，n=10；TGP:TGP治疗组，n=8。与NC组比较:*P<0.05；与MS组比较:##P<0.01

2.2 社会交互实验结果

图2示，与正常组比较，母婴分离组小鼠的训练探查时间增加，差异无统计学意义(P>0.05)，辨别探查时间明显增加且差异有统计学意义(P<0.05)；白芍总苷组可明显缩短母婴分离小鼠的训练探查时间(P<0.05)和辨别探查时间(P<0.01)，差异均有统计学意义。2次试验中，3组小鼠之间的远角停留时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：社会交互实验(social interaction test)A：训练探查时间(training exploration time)，B：辨别探查时间(discrimination exploration time)，C：第1次远角停留时间(distant residence time in training trial)，D：第2次远角停留时间(distant residence time in adaptation trial)；结果以表示；NC:对照组，n=10；MS:母婴分离组，n=10；TGP:TGP治疗组，n=8。与NC组比较:*P<0.05;与MS组比较:#P<0.05，##P<0.01

2.3 免疫组化实验结果

图3、4与图5示，与正常组比较，母婴分离组小鼠的Iba-1阳性表达产物IOD值在海马CA1区、海马CA3区及下丘脑均显著增加(P<0.01)，且母婴分离组小鼠小胶质细胞胞体明显变大，突起回缩；TGP组与母婴分离组比较，Iba-1阳性表达IOD值均显著降低(P<0.01)，且胞体明显变小，差异有统计学意义。

注：NC：对照组，n=6；MS：母婴分离组，n=6；TGP：TGP治疗组，n=6。A-F为免疫组化染色图：(A和B)NC组，(C和D)MS组，(E和F)TGP组；A、 C和E，放大倍数×20，比例尺，500 μm；B、D和F：放大倍数×100，比例尺，200 μm；B、D和F中的箭头表示Iba-1阳性细胞；(G)各组大鼠海马CA1区Iba-1的IOD值；与NC组比较：**P<0.01，与MS组比较：##P<0.01

注：NC：对照组，n=6；MS：母婴分离组，n=6；TGP：TGP治疗组，n=6。HM为免疫组化染色图：(H和I)NC组，(J和K)MS组，(L和M)TGP组；H、J和L，放大倍数×20，比例尺，500 μm；I、K和M：放大倍数×100，比例尺，200 μm；I、K和M中的箭头表示Iba-1阳性细胞；(N)各组大鼠海马CA3区Iba-1的IOD值；与NC组比较：**P<0.01，与MS组比较：##P<0.01

注：NC：对照组，n=6；MS：母婴分离组，n=6；TGP：TGP治疗组，n=6。OT为免疫组化染色图：(O和P)NC组，(Q和R)MS组，(S和T)TGP组；O、Q和S，放大倍数x20，比例尺，500 μm；P、R和T：放大倍数×100，比例尺，200μm；P、R和T中的箭头表示Iba-1阳性细胞；(N)各组大鼠海马下丘脑区Iba-1的IOD值；与NC组比较：**P<0.01，与MS组比较：##P<0.01

3 讨论

TGP是从芍药根中提取的有效成分，能够减轻多种疾病的免疫反应[18]。本研究结果显示，口服TGP能够有效调节母婴分离模型小鼠的行为并改善其相关脑区的小胶质细胞活化。

在30 min的旷场实验中，MS(8 h)小鼠与正常组小鼠相比运动总距离增加，提示动物处于多动与焦虑的状态。社会交互实验中，MS小鼠在第1次和第2次接触未知个体时都表现出比对照组更长的探索时间。据此推断当MS小鼠长大后，早期母婴分离可能改变其在陌生环境中的行为反应，使其在未知区域与陌生个体接触时无法正确评估环境并及时规避可能的风险。同时也意味着，MS小鼠成年后在一定程度上出现认知能力的下降，这是抑郁症的潜在症状之一。

课题组前期研究发现，长期与反复的MS会增加小鼠的焦虑样行为，并提高其成年后的抑郁易感性。有研究显示，MS(3 h)可使女性的社交能力增强，而男性则完全不受影响，轻度的早年应激可能对个体的后期行为反应有积极的影响，甚至能够使其在面对强烈的压力时更容易适应[19-20]。但长期MS(超过4 h)能造成啮齿类动物下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴显著失调，增加其焦虑、抑郁样行为。这与本课题组的研究结果一致[21]。本次研究发现，TGP对旷场与社会交互实验中模型小鼠异常的行为学变化起到了显著的干预作用。

为探讨MS引起行为学改变的生物学机制，本研究通过免疫组化方法检测了小鼠海马和下丘脑小胶质细胞标志物Iba-1的表达。小胶质细胞是唯一存在于大脑中的免疫细胞，它对外界或内部的刺激非常敏感，任何可能破坏中枢神经系统稳态的微小刺激都会引起小胶质细胞的激活。这种激活可表现为细胞形态及功能状态2个方面，活化后的小胶质细胞在细胞形态上表现为胞体增大、凸起回缩[22]，由分枝样的静止状态转变成阿米巴虫样的活化状态[23]；功能状态方面，小胶质细胞被迅速活化后开始吞噬与清除凋亡、坏死和受损的神经元[24-25]，从而抑制炎症发展，但过度的吞噬作用和免疫反应会使小胶质细胞活化过度，进而释放出大量的炎性因子、细胞毒性物质等多种介质，从而加重炎症反应[26-27]。由小胶质细胞过度激活而导致的神经炎症是引起认知能力下降和神经元突触功能异常的最直接原因，而认知能力下降是抑郁症的典型症状。多项研究证实，抑郁症患者常出现海马区体积缩小、下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴功能异常等表现[28]。本次研究结果发现，MS小鼠的海马和下丘脑区域小胶质细胞的胞体明显增大，阳性产物的数量与密度明显增加，表明小胶质细胞已被激活。TGP对激活的小胶质细胞表现出显著的抑制作用。在临床上TGP已被广泛应用于RA和SLE的治疗[29]。多项实验研究表明，TGP具有抗炎和免疫调节作用，动物实验发现，TGP可以呈剂量依赖性地对抗皮质酮诱导的神经毒性[30]。有学者发现，TGP在HPA轴失调的大鼠中表现出抗抑郁的作用[31]。本研究表明，TGP降低了母婴分离小鼠海马和下丘脑脑区小胶质细胞的表达，提示TGP在中枢神经系统中能够发挥免疫调节作用，进而对其成年后抑郁易感性产生一定的影响。

TGP是中药白芍的主要有效成分。《本草纲目》有云：“白芍药益脾，能于土中泻木。”数据挖掘研究发现，白芍→当归及白芍→甘草药对是治疗抑郁方剂的基本药对，在抑郁症治疗中具有举足轻重的地位，也是具有疏肝健脾功效的中药名方逍遥散的重要组成部分[32]。大量临床与实验研究都发现，逍遥散具有较好的抗抑郁效果，其抗抑郁的药理成分主要包括芍药苷和柴胡皂苷等[33]。本研究对TGP的分子机制进行了进一步的研究，发现其对抗免疫激活的作用可能是其干预MS小鼠成年后抑郁易感性的可能机制之一，这在一定程度上证实炎症与抑郁的密切关系，与中药能通过多靶点、多途径发挥综合效应的作用特点。总之，TGP可能成为治疗抑郁症的潜在药物，今后课题组将继续进行相关研究。