穴位埋线对变应性鼻炎大鼠炎症介质、细胞因子及JNK通路的调节作用❋

郑晓娟， 张艳梅， 王晓燕

(河南中医药大学郑州市中医院， 郑州 450000)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是临床常见的变态反应性疾病，其病因是机体接触过敏原后免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)大量释放并介导鼻黏膜中炎症反应激活[1]，IgE释放后与其受体结合后能够促进嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin)释放，引起多种细胞因子分泌异常，进而引起鼻黏膜发生病理改变，同时也加重鼻黏膜中体液免疫应答的紊乱[2-3]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的重要成员之一。该通路的激活参与哮喘、AR等多种过敏性疾病的发病。

AR属于中医“鼻鼽”范畴，该病气阳虚衰为本、外感风邪为标，治疗应以升阳益气、健脾益气为主[4-5]。穴位埋线是以针灸经络理论为指导的中医治疗手段。已有研究报道，选取百会、肺俞、脾俞3个穴位进行埋线是治疗AR的有效手段[6-7]。为阐明穴位埋线治疗AR的机制，本研究以AR模型大鼠为实验对象，观察了穴位埋线对AR大鼠炎症介质、细胞因子及JNK通路的影响，旨在进一步明确穴位埋线治疗AR的作用，并探讨介导这一作用的分子机制，为穴位埋线临床治疗AR提供理论基础。本研究已通过河南中医药大学实验动物伦理委员会审查，批号V20200908。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量140～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物合格证号SCXK(沪)2017-0005，饲养在河南中医药大学动物中心，温度18～25 ℃，适度50%～60%，自由光照。

1.2 试剂与仪器

卵清蛋白(货号O1641、5 mg/支)，Sigma公司；氢氧化铝(货号A800852、500 g/瓶)，上海麦克林生化科技有限公司；丙酸倍氯米松(货号5534-09-8、1000 g/瓶 )，武汉泽诺生物科技有限公司；4-0医用羊肠线，上海浦东金环医疗用品股份有限公司；HE染色试剂盒(货号ZLI-9018)，北京中杉金桥生物公司；IgE(货号F15751)、Eotaxin(货号F15330)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(货号F15730)、白介素(interleukin)-4(货号F15850)、IL-5(货号F15860)、IL-17(货号F15940)酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒，上海西唐公司；JNK、p-JNK的单克隆一抗(货号9252)，CST公司；显微镜，日本尼康公司；凝胶成像系统，上海天能公司。

1.3 模型制备与分组

实验动物随机分为对照组和造模组，对照组共10只，造模组参照田永萍等[7]研究按照下列方法制备AR模型。第1～14天，腹腔注射含有0. 3 mg卵清蛋白及30 mg氢氧化铝的0.9%氯化钠溶液1 mL，隔日1次共7次，该阶段为致敏阶段；第15～21天，用0.9%氯化钠溶液配置含有2%卵清蛋白的混悬液，双侧鼻孔各滴入0.05 mL，每日1次，连续7次，该阶段为激发阶段。完成造模后，参照田永萍等[7]研究对鼻痒、喷嚏、清涕的症状进行评分。鼻痒：轻擦鼻几次为1分，抓挠鼻、面不止，到处摩擦为2分；喷嚏：1～3个为1分，4～10个为2分，11个及以上为3分；清涕：流涕至前鼻孔为1分，流涕过前鼻孔为2分，流涕满面为3分，总得分超过5分为造模成功。将造模成功的30只大鼠进一步随机分为模型组、西药组、埋线组每组各10只，第22天开始对各组大鼠进行干预共治疗4周。

1.4 各组处理方法

西药组给予丙酸倍氯米松双侧滴鼻(0.18 mg/kg)，每日1次，连续4周。埋线组分2阶段进行穴位埋线治疗：第一阶段为第1～2周，选择“百会”、双侧“肺俞”穴埋线1次；第二阶段为第3～4周，选择“百会”“肺俞”“脾俞”穴埋线1次。穴位根据《实验针灸学》[8]的大鼠穴位图谱，“百会”在顶骨正中，用9号埋线针向前或后斜刺2 mm；“肺俞”为第三胸椎棘突下两旁肋间，直刺5 mm，“脾俞”为第十二胸椎下两旁肋间，直刺5 mm。确定穴位后，对穴位及周围皮肤进行消毒，用9号埋线针将4-0羊肠线埋入，埋线长度约2～3 mm。对照组及模型组不进行特殊处理。

1.5 观察指标及检测方法

治疗结束后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg麻醉后，经心脏负压采血5～6 mL，离心后收集血清，采用ELISA试剂盒检测IgE、Eotaxin、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的含量，操作均按照试剂盒说明书进行。颈椎脱臼处死大鼠，打开鼻腔并解剖鼻黏膜组织，0.9%氯化钠溶液清洗后分为两份，一份用4%多聚甲醛固定后制作石蜡切片，用于HE染色并在显微镜下观察病理改变。另一份用液氮冷冻后加入RIPA裂解液提取蛋白，采用ELISA试剂盒检测IgE、Eotaxin、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的含量，按照试剂盒说明书进行操作。另取组织蛋白适量，蛋白样本在凝胶电泳系统内进行电泳、电转硝酸纤维素(NC)膜，5%脱脂牛奶封闭后孵育JNK、p-JNK及β-actin的一抗，4 ℃过夜。次日，孵育HRP二抗，室温1～2 h，在凝胶成像系统显影，以β-actin为内参，根据蛋白条带的灰度值计算表达水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠症状评分及鼻黏膜病理切片HE染色比较

表1显示，模型组大鼠症状评分增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。干预后，西药组、埋线组大鼠症状评分较干预前降低，且症状评分低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与西药组比较，埋线组大鼠症状评分差异无统计学意义(P>0.05)，提示西药及埋线治疗干预均能改善AR症状，且西药与埋线效果相当。

表1 各组大鼠症状评分比较

图1显示，对照组大鼠鼻黏膜形态正常，无炎症细胞浸润；模型组大鼠鼻黏膜可见组织水肿充血明显，大量炎症细胞浸润；西药组、埋线组大鼠鼻黏膜可见组织水肿充血改善，炎症细胞浸润减少，提示模型组大鼠出现了AR相关的病理改变，穴位埋线及西药均能够改善AR的病理改变。

注：箭头所指为浸润的炎症细胞

2.2 各组大鼠血清及鼻黏膜中炎症介质比较

表2示，模型组大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。干预后，西药组、埋线组大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与西药组比较，埋线组大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量差异无统计学意义(P>0.05)，提示西药及埋线治疗干预均能抑制模型大鼠炎症介质Eotaxin、IgE的分泌，且西药与埋线的效果相当。

表2 各组大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量比较

2.3 各组大鼠血清及鼻黏膜中细胞因子比较

表3显示，模型组大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量减少，IL-4、IL-5、IL-17的含量增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。干预后与模型组比较，西药组、埋线组大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量增加(P<0.01)，IL-4、IL-5、IL-17的含量降低(P<0.01)；与西药组比较，埋线组大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17含量差异无统计学意义(P>0.05)，提示西药及埋线治疗干预均能调节模型大鼠细胞因子的分泌，且西药与埋线的效果相当。

表3 各组大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17含量比较

2.4 各组大鼠鼻黏膜中p-JNK、JNK表达的比较

图2表4显示，各组间JNK的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠鼻黏膜中p-JNK的表达水平增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。干预后与模型组比较，西药组鼻黏膜中p-JNK的表达水平无明显变化(P>0.05)，埋线组大鼠鼻黏膜中p-JNK的表达水平降低(P<0.01)。

图2 各组大鼠鼻黏膜中p-JNK及JNK的蛋白条带

表4 各组大鼠鼻黏膜中p-JNK、JNK表达水平比较

3 讨论

穴位埋线属于通过局部埋入羊肠线来对穴位产生物理及生化刺激，进而通过经络将刺激传入体内，最终起到治疗疾病的作用。AR属于中医理论“鼻鼽”范畴，其病机在于肺脾肾功能失调，针对病机选择百会肺俞脾俞穴进行针灸或埋线可以起到治疗作用[9-10]。本研究在AR大鼠中选择“百会”“肺俞”“脾俞”3个穴位进行埋线治疗。

AR的病理本质是IgE介导的鼻黏膜炎症反应，已有多项AR相关的动物研究采用鼻黏膜HE染色病理改变评价不同手段治疗AR的疗效，认为通过HE染色观察病理改变具有直观性及客观性均较强的优点[11-12]。本实验观察到，模型组大鼠的鼻黏膜出现了水肿充血、炎症细胞浸润等典型的AR病理改变；在穴位埋线及西药治疗后，AR的病理改变均明显改善，因此笔者认为穴位埋线用于AR治疗能够减轻鼻黏膜损伤，抑制炎症细胞浸润。

本研究通过HE染色观察鼻黏膜的病理改变后，还通过分子生物学实验方法检测参与AR病理改变的多种分子变化，以此进一步确认穴位埋线治疗AR的价值。IgE介导炎症反应激活在AR发病中起重要作用，接触过敏原后IgE的大量释放能够引起嗜酸性粒细胞向鼻黏膜迁移、浸润，进而释放炎症介质Eotaxin来介导炎症反应，引起黏膜损伤。在HE染色中已经观察到，模型大鼠鼻黏膜中有嗜酸性粒细胞的大量浸润，进一步观察炎症介质IgE及Eotaxin的变化，发现模型组血清及鼻黏膜中IgE、Eotaxin的含量均增多，而西药组和埋线组血清及鼻黏膜中IgE、Eotaxin的含量均减少，且2组间IgE、Eotaxin比较无差异。因此笔者认为，穴位埋线用于治疗AR能够抑制炎症反应，且抑制作用与西药相当。

已有多项研究证实，Th1、Th2、Th17失衡与AR发病有关，相应细胞因子在AR发病过程中也出现了改变[13-15]。在过敏原刺激IgE释放的过程中，Th1产生的细胞因子IFN-γ介导细胞免疫应答并抑制IgE的释放，Th2产生的细胞因子IL-4、IL-5介导体液免疫应答并促进IgE的释放；同时，IgE还能招募Th17细胞不断浸润并分泌IL-17，进而起到趋化作用并加重鼻黏膜的病理改变[13-15]。本研究对AR模型大鼠上述细胞因子的分析与既往其他学者[13-15]的研究一致，即模型组血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量降低，IL-4、IL-5、IL-17的含量增多；而在治疗后，西药组及埋线组的上述细胞因子均明显改善。因此笔者认为，穴位埋线用于治疗AR能够调节多种细胞因子的释放，且调节作用与西药相当。

在穴位埋线用于非酒精性脂肪肝大鼠治疗的实验中，穴位埋线被证实能够通过抑制JNK通路的激活来改善胰岛素抵抗及炎症反应[16]，提示JNK通路可能是穴位埋线发挥治疗作用的靶点。JNK通路是调节炎症反应与免疫应答的重要信号通路，信号分子JNK发生磷酸化是信号通路激活的方式，表现为p-JNK表达增加。陈超蕾等研究证实，在脂多糖诱导的肺组织炎症中，JNK通路的激活与多种ILs的异常分泌有关[17]；肖文艳等研究证实，在金葡菌刺激巨噬细胞活化的过程中，JNK通路的激活介导了IL-5的分泌[18]；Xiong Y等研究证实，在气道过敏小鼠中，JNK通路的激活能刺激Eotaxin的释放[19]。本实验对JNK通路的分析结果与既往研究报道一致，即模型组鼻黏膜中p-JNK的表达增多；进一步分析治疗后JNK通路的变化可知，埋线组鼻黏膜中p-JNK的表达减少，而西药组鼻黏膜中p-JNK的表达无明显变化。结合既往其他学者报道JNK通路对IL-5、Eotaxin等的调控作用，笔者认为穴位埋线治疗抑制炎症介质释放、调节细胞因子释放的作用与抑制JNK通路激活有关，但其具体的分子机制仍有待进一步研究的加以验证。