响应面法优化羽毛降解菌Ochrobactrum intermedium JY-25的降解培养基

凌晓宁，刘 群，张 荣，章启慧，章帅文，李昆太,4*

响应面法优化羽毛降解菌Ochrobactrum intermedium JY-25的降解培养基

凌晓宁1，刘 群2，张 荣1，章启慧1，章帅文3，李昆太1,4*

（1. 江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045；2. 江西交通职业技术学院 信息工程系，江西 南昌 330013；3. 江西省科学院 微生物研究所，江西 南昌 330096；4. 广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088）

【目的】作为构成羽毛主要成分的角蛋白，因其存在大量相互交联的二硫键、氢键和盐键等化学键，导致羽毛结构稳定难以被常规手段降解。相较于物理、化学方法降解废弃羽毛，利用微生物产生的角蛋白酶使废弃羽毛变成可再生资源，具有高效、环保的优点。课题组前期从家禽养殖场的土壤中分离、筛选到一株羽毛降解菌，经鉴定该菌株为中间苍白杆菌JY-25。研究旨在进一步提高中间苍白杆菌JY-25的羽毛降解率，为今后工业化降解废弃羽毛提供依据。【方法】依次采用单因素试验、Plackett-Burman试验设计和响应面法对中间苍白杆菌JY-25的羽毛降解培养基进行优化。【结果】通过单因素试验确定了在降解培养基中外加碳源（糊化淀粉）和氮源（玉米粉）时，都能提高羽毛的降解率。Plackett-Burman试验设计发现降解培养基的8种成分中，糊化淀粉、硫酸亚铁和羽毛量是影响中间苍白杆菌JY-25对羽毛降解率的显著因素。最后通过响应面法确定了最佳降解培养基的组分为：羽毛2 g/L、糊化淀粉15 g/L、玉米粉10 g/L、硫酸亚铁0.02 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、氯化钠0.3 g/L、硫酸镁0.025 g/L、氯化钙0.025 g/L，在该优化的培养基配方下，菌株JY-25的羽毛降解率高达76.31%，相较于初始的降解率提高了24.4%。【结论】经过多种优化方式，显著地提高了中间苍白杆菌JY-25的羽毛降解率，为菌株用于工业化降解废弃羽毛提供了理论基础。

羽毛；中间苍白杆菌JY-25；Plackett-Burman试验设计；响应面法；降解培养基优化

【研究意义】近年来，随着肉制品的消费，全球每年会产生几千万吨角蛋白废物，而羽毛废物约占850万t[1]。羽毛是由90%的角蛋白组成，角蛋白又存在α-角蛋白和β-角蛋白之分，其中α-角蛋白主要存在于人和动物的毛发中，β-角蛋白主要存在于人的指甲、动物的蹄、角和羽毛中[2, 3]。由于角蛋白链紧密堆积在α-角蛋白和β-角蛋白中，形成超螺旋多肽链，从而产生机械稳定性，导致其对常见蛋白水解酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜水解酶等）具有较强的抵抗力[4]。当前，对于羽毛的降解常采用高温高压、强酸强碱、填埋或焚烧等物理化学方法，但这些降解过程不仅会导致大量必需氨基酸的流失，而且还存在能源的巨大消耗，给环境造成压力[5]。微生物法降解羽毛作为另一种降解羽毛的方法，由于在降解过程中不仅能避免氨基酸的破坏，而且高效环保，近年来越来越受到重视[6]。当前，已经分离到能够降解羽毛的微生物，主要来自于细菌、真菌、放线菌等[7-8]。【前人研究进展】响应面法是将统计与数学方法结合，用于选择最佳的实验条件，以最少的实验次数获得最合适的结果[9]。吴翔等[10]利用响应面法优化了烟草根际促生菌MT-002-B-12产吲哚-3-乙酸的发酵条件。肖美娟等[11]利用响应面法优化了羰基还原酶产生菌的发酵培养基，优化后的发酵培养基菌体酶活和生物量分别比优化前提高了233.33%和20.39%。蒋彪等[12]利用响应面法优化了芽孢杆菌CJPE209产角蛋白酶的发酵培养基，在最优培养基条件下角蛋白酶酶活较优化前提高了20.74%。Ambati等[13]利用响应面法优化了柠檬酸生产的培养基组成及发酵条件。Kieu等[14]利用响应面法优化了厌氧菌株从可溶性淀粉中产氢气的培养条件。Abdul Gafar等[15]利用响应面法优化了芽孢杆菌UPM-AAG1在含羽毛培养基中产角蛋白酶的条件。

【本研究切入点】目前，对于废弃羽毛的大规模生物降解利用，还处在实验室研究阶段，未找到能工业化降解羽毛的菌株。本研究以课题组筛选到的一株羽毛降解菌株为出发菌株，优化了该菌株对羽毛的降解率。【拟解决的关键问题】研究依次通过用单因素试验、Plackett-Burman试验设计和响应面法提高菌株对羽毛的降解率，使菌株的降解率得到显著提高，为后期该菌株工业化降解羽毛和实现蛋白质资源的再生利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株 中间苍白杆菌（）JY-25，现保存于江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室。

培养基 LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。降解培养基：羽毛4 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，CaCl20.025 g，FeSO4·7H2O 0.015 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃灭菌20 min。

1.2 单因素优化菌株对羽毛的降解率

菌株JY-25对羽毛的降解 用20 mL带有玻璃珠的无菌水将保存的菌株JY-25斜面洗出，充分摇匀制成菌体悬液。吸取200mL的菌悬液加入到装有40 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，在37 ℃、160 r/min培养12 h得到种子液。按2%的接种量接种种子液于降解培养基中，继续在37 ℃、160 r/min条件下培养72 h。

羽毛降解率的测定 将发酵好的天然羽毛用4层纱布过滤，所得的滤渣置于恒温干燥箱中，于80 ℃下干燥至恒质量，称其质量，按如下公式计算羽毛的降解率：

1.2.1 外加碳源对菌株降解羽毛的影响 在降解培养基的基础上，分别外加10 g/L的甘露醇、糊化淀粉、淀粉、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖和蔗糖，以不加任何碳源为对照，每组3个重复。通过对羽毛降解率的测定，考察外加碳源对菌株降解羽毛的影响。

1.2.2 外加氮源对菌株降解羽毛的影响 在初始降解培养基的基础上，分别外加10 g/L的硝酸铵、硝酸钾、氯化铵、牛肉膏、硫酸铵、尿素、玉米粉、黄豆饼粉、酵母浸粉和蛋白胨，以不加任何氮源为对照，每组3个重复。通过对羽毛降解率的测定，考察外加氮源对菌株降解羽毛的影响。

1.3 Plackett-Burman试验设计筛选降解培养基显著因子

选择11个因素，通过Plackett-Burman设计12次实验，考察改良的降解培养基的8个因素对天然羽毛降解率的影响，每个因素分为高（+1）和低（-1）两个水平，以羽毛的降解率为响应值，挑选出置信度大于95%的因素作为显著因素。另外增加3个因素为虚拟变量，用于估计误差。试验设计见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平

1.4 响应面优化菌株对羽毛的降解率

从Plackett-Burman试验设计的结果中，筛选出对羽毛降解率影响显著的3个因子。根据中心组合设计的原理，以羽毛降解率为响应值，设计3因素5水平试验来确定降解培养基最佳组分，采用Design-expert 8.0软件对试验结果进行回归分析和方差分析，试验设计见表2。

表2 中心组合试验设计因素与水平

1.5 数据统计与分析

使用Excel 2019进行数据统计，使用Design-expert 8.0软件对PB试验和中心组合试验进行方差分析，使用Origin 2018对数据进行作图分析，photoshop CC 2019进行图像处理。在统计学上＜0.05认为差异显著、＜0.01差异极显著、＞0.05差异不显著。

2 结果与分析

2.1 外加碳源对菌株降解率影响

外加碳源对菌株降解率的影响如图1所示，从图1可知，与空白对照组相比，果糖、阿拉伯糖、麦芽糖的加入使羽毛的降解率大幅下降，当使用糊化淀粉作为外加碳源时，羽毛的降解率最大，可以达到54.52%。故选择糊化淀粉作为降解培养基的外加碳源。

2.2 外加氮源对菌株降解率的影响

外加氮源对菌株降解率的影响如图2所示，从图2可知，与空白对照组相比，只有降解培养基中加入玉米粉时，羽毛的降解率才有所提升，其它种类的氮源对于羽毛的降解率没有促进作用。外加氮源为玉米粉时，羽毛的降解率达到55.8%。因此选择玉米粉为降解培养基的外加氮源。

图1 外加碳源种类对菌株JY-25降解羽毛的影响

2.3 Plackett-Burman试验分析

Plackett-Burman试验设计与结果如表3所示，利用Design-expert 8.0软件对结果进行方差分析，结果如表4所示。模型的值在95%的置信区间内小于0.05，其决定系数2=0.988 9，校正系数为0.959 2，说明模型能解释95.92%的实验数据，证明此模型合理。由表4可知，=0.05时，糊化淀粉、硫酸亚铁和羽毛量的值在95%的置信区间内都小于0.05，表明糊化淀粉、硫酸亚铁和羽毛量是影响菌株对羽毛降解率的显著因素。

表3 Plackett-Burman 试验设计与结果

表中最终值为3次重复试验的均值，下同

表4 Plackett-Burman试验方差分析

“*”表明差异显著，<0.05；“**”表明差异极显著，<0.01；下同

2.4 响应面试验分析

利用Design-expert 8.0软件进行中心组合试验设计，其试验结果如表5所示，选取糊化淀粉（A）、硫酸亚铁（B）和羽毛（C）为试验因素，以羽毛的降解率（）为响应值。对中心组合试验结果进行多元回归拟合，得到羽毛降解率的二次回归模型方程为：

=64.98+3.37A-0.23B-8.81C+0.78AB-4.26AC+0.52BC-0.60A2-0.95B2-4.51C2

方程中表示羽毛降解率（%），A、B、C分别表示糊化淀粉、硫酸亚铁、羽毛在培养基中的浓度（g/L）。方程中C的系数较大，表明羽毛量对菌株降解羽毛的降解率最具有显著性意义。

对二次回归模型进行方差分析，结果如表6所示。由表6可知，此模型的值为0.008 0，远小于0.05，模型的多元相关系数2=0.825 5，校正系数Adj2=0.668 4，表明该模型拟合度良好。失拟项值为0.500 5，差异不显著(>0.05)，表明该回归方程拟合度较高，可以用此数学模型推测试验的结果。其中差异不显著（>0.05）有A，B，AB，AC，BC，A2和B2，差异显著（0.01<<0.05）有C2，差异极显著有C，以表7的和值为比较标准，影响羽毛降解率的因素由大到小依次为羽毛（C），糊化淀粉（A），硫酸亚铁（B）。

表5 中心组合试验设计与结果

表6 响应面二次模型的方差分析

2.5 响应面交互作用分析

分别将糊化淀粉（A）、硫酸亚铁（B）、羽毛（C）中的一个因子固定在中心点水平，分析另外两个因素及其交互作用对羽毛降解率的影响。其等高线和响应面如图3～5所示。由图3～5等高线图可知，糊化淀粉（A）、硫酸亚铁（B）、羽毛（C）3个因素之间两两交互作用不明显，这与方差分析结果一致。由图3～5响应面图可知，糊化淀粉的响应面变化坡度最陡（图3，图4），且随着糊化淀粉浓度的提高，羽毛降解率显著提升；羽毛的响应面变化曲折（图4，图5），随着羽毛含量的提高，羽毛降解率先上升后下降；硫酸亚铁的响应面变化较平缓（图3，图5），随着硫酸亚铁浓度的提高，羽毛降解率呈现平缓趋势。

图3 糊化淀粉和硫酸亚铁对羽毛降解率的等高线和响应面

图4 糊化淀粉和羽毛量对羽毛降解率的等高线和响应面

图5 硫酸亚铁和羽毛量对羽毛降解率的等高线和响应面

2.6 响应面最优工艺分析

利用Design-expert 8.0软件分析响应面的最优工艺，可得到一个理论上羽毛的降解率最高的组合为：糊化淀粉15 g/L、硫酸亚铁0.02 g/L和羽毛2 g/L，此时羽毛的降解率为76.31%。由此得到菌株JY-25降解羽毛的最适培养基组成为：羽毛2 g/L、糊化淀粉15 g/L、玉米粉10 g/L、硫酸亚铁0.02 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L，氯化钠0.3 g/L，硫酸镁0.025 g/L，氯化钙 0.025 g/L。

3 结论与讨论

响应面法可以从众多因素中快速筛选出关键因素并优化培养条件，可以避免单因素优化带来的缺陷，是一种高效而简便的方法[16]。该方法已成功应用于化工、工程、生物等许多领域[17-19]。研究以实验室筛选的一株羽毛降解菌JY-25为出发菌株，在单因素实验的基础上，采用软件Design-expert 8.0进行响应面试验设计，以羽毛降解率作为响应值，对羽毛的降解培养基进行优化。

通过单因素试验确定了在降解培养基中外加碳源（糊化淀粉）和氮源（玉米粉）时，都能提高羽毛的降解率。Plackett-Burman试验设计发现降解培养基的8种成分中，糊化淀粉、硫酸亚铁和羽毛量是影响中间苍白杆菌JY-25对羽毛降解率的显著因素。最后通过响应面法确定了最佳降解培养基的组分为：羽毛2 g/L、糊化淀粉15 g/L、玉米粉10 g/L、硫酸亚铁0.02 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、氯化钠0.3 g/L、硫酸镁0.025 g/L、氯化钙0.025 g/L，在该优化的培养基配方下，菌株JY-25对羽毛的降解率高达76.31%，相较于初始的降解率提高了24.4%，大大提高了废弃羽毛的利用率。研究通过优化羽毛降解菌JY-25的降解培养基，提高了废弃羽毛的降解率，不仅可以保护环境，还可以促进可持续发展，在蛋白质饲料生产中具有广阔的应用前景，可为后期工业化降解羽毛提供理论基础。

[1] PENG Z, MAO X, ZHANG J, et al. Biotransformation of keratin waste to amino acids and active peptides based on cell-free catalysis[J]. Biotechnol biofuels, 2020,13(1): 61.

[2] BOHACZ J. Biodegradation of feather waste keratin by a keratinolytic soil fungus of the genusand statistical optimization of feather mass loss[J]. World journal of microbiol biotechnol, 2017,33(1): 13.

[3] 蒋彪. 角蛋白酶产生菌的筛选、发酵优化、酶学特性及应用[D]. 武汉: 湖北工业大学, 2017.

[4] RIFFEL A, LUCAS F, HEEB P, et al. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin[J]. Archives of microbiology, 2003,179(4): 258-265.

[5] IZABELA S, AGATA L, HANNA S, et al. Alternative methods of preparation of soluble keratin from chicken feathers[J]. Waste and biomass valorization, 2017, 8(4): 1-6.

[6] LIYUAN W, GUYUE C, YUXIA R, et al. Degradation of intact chicken feathers bysp. CDF and characterization of its keratinolytic protease[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2015, 99(9): 3949-3959.

[7] 颜华, 柯欣, 吴佳, 等. 角蛋白高效降解菌Fea-10的筛选与鉴定[J]. 中南民族大学学报(自然科学版), 2017, 36(2): 30-34.

[8] RAMAKRISHNA REDDY M, SATHI REDDY K, RANJITA CHOUHAN Y, et al. Effective feather degradation and keratinase production byGRK for its application as bio-detergent additive[J]. Bioresour technol, 2017, 243, 254-263.

[9] OMARA A, SHARAF A, EL-HELA A A, et al. Optimizing ectoine biosynthesis using response surface methodology and osmoprotectant applications[J]. Biotechnol lett, 2020, 42(6): 1003-1017.

[10] 吴翔, 谢丽源, 谭昊, 等. 一株烟草根际促生菌的鉴定及响应面法优化其发酵条件[J]. 农业生物技术学报, 2019, 27(12): 2248-2257.

[11] 肖美娟, 朱治任, 刘月旺, 等. 响应面法优化羰基还原酶产生菌发酵培养基[J]. 生物加工过程, 2021, 19(1): 47-53.

[12] 蒋彪, 王常高, 杜馨, 等. 响应面法优化芽孢杆菌CJPE209产角蛋白酶发酵培养基的研究[J]. 中国酿造, 2017, 36(5): 76-80.

[13] AMBATI P, AYYANNA C. Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method[J]. World journal of microbiology and biotechnology, 2001, 17(4): 331-335.

[14] KIEU H T Q, NGUYEN Y T, DANG Y T, et al. Use of Response surface methodology to optimize culture conditions for hydrogen production by an anaerobic bacterial strain from soluble starch[J]. Journal of electronic materials, 2016, 45(5): 2632-2638.

[15] ABDUL GAFAR A I, KHAYAT M E, AHMAD S A, et al. Response surface methodology for the optimization of keratinase production in culture medium containing feathers bysp. UPM-AAG1[J]. Catalysts, 2020, 10(8): 848.

[16] YANG F, LONG L, SUN X, et al. Optimization of medium using response surface methodology for lipid production bysp.[J]. Marine drugs, 2014, 12(3): 1245-1257.

[17] GARG A, JAIN S. Process parameter optimization of biodiesel production from algal oil by response surface methodology and artificial neural networks[J]. Fuel, 2020, 277: 118254.

[18] PANDIAN M, SIVAPIRAKASAM S P, UDAYAKUMAR M. Investigation on the effect of injection system parameters on performance and emission characteristics of a twin cylinder compression ignition direct injection engine fuelled with pongamia biodiesel-diesel blend using response surface methodology[J]. Applied energy, 2011, 88(8): 2663-2676.

[19] JAAFARI J, YAGHMAEIAN K. Optimization of heavy metal biosorption onto freshwater algae () using response surface methodology (RSM)[J]. Chemosphere, 2019, 217: 447-455.

Optimization of the Degradation Medium of Feather-degrading BacteriaJY-25 by Response Surface Methodology

LING Xiaoning1, LIU Qun2, ZHANG Rong1, ZHANG Qihui1, ZHANG Shuaiwen3, LI Kuntai1,4*

（1. College of Biological Sciences and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2.Department of Information Engineering,Jiangxi Vocational and Technical College of Communications, Nanchang 330013, China; 3. Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China; 4. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088, China）

Keratin, the main component of feathers, has a large number of cross-linked disulfide bonds, hydrogen bonds, and salt bonds among other chemical bonds, makes the feather structure stable and difficult to be degraded by conventional means. Compared with the degradation of waste feathers by physical and chemical methods, the use of keratinase produced by microorganisms to turn waste feathers into renewable resources has the advantages of high efficiency and environmental protection. The research team isolated and screened a feather-degrading bacterium from the soil of the poultry farm in the early stage, and the strain was identified asJY-25, which could be used to further improve the feather degradation rate ofJY-25 to deal with waste feathers industrially in the future.The single factor test, Plackett-Burman test designs and response surface methods were used to optimize the feather degradation medium ofJY-25.Through single-factor experiments, it was determined that adding carbon sources (gelatinized starch) and nitrogen sources (corn meal) to the degradation medium could increase the degradation rates of feathers. The Plackett-Burman experimental designs found that among eight components of the degradation medium, gelatinized starch, ferrous sulfate and feather amount were significant factors affecting the degradation rates ofJY-25 on feathers. Finally, the components of the optimal degradation medium were determined by response surface methodology: feather 2 g/L, gelatinized starch 15 g/L, corn flour 10 g/L, ferrous sulfate 0.02 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1.5 g/L, sodium chloride 0.3 g/L, magnesium sulfate 0.025 g/L, and calcium chloride 0.025 g/L. Under the optimized medium formula, the degradation rate of the strain JY-25 on feathers was as high as 76.31%, which increased by 24.4% compared with the initial degradation rate.After a variety of optimization methods, the feather degradation rate ofJY-25 had been significantly improved, providing a theoretical basis for the strain to be used for the industrial degradation of discarded feathers in the future.

feather;JY-25; Plackett-Burman experimental design; response surface methodology; optimization of degradation medium

Q939.96

A

2095-3704（2021）02-0228-09

2021-03-11

2021-04-26

国家自然科学基金项目（31760546）

凌晓宁（1995—），男，硕士生，主要从事微生物资源开发与利用方面的研究，705377915@qq.com；*通信作者：李昆太，教授，博士，atai78@sina.com。

凌晓宁, 刘群, 张荣, 等. 响应面法优化羽毛降解菌JY-25的降解培养基[J]. 生物灾害科学, 2021, 44(2): 228-236.