组培条件下空心莲子草匍匐茎段根系发育的研究

郭雅琪，姚 振，陈中义

组培条件下空心莲子草匍匐茎段根系发育的研究

郭雅琪，姚 振，陈中义*

（长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 434025）

【目的】空心莲子草是一种世界范围的恶性入侵杂草，其贮藏根的形成在其入侵中具有重要作用，对其不定根的发生及其膨大情况进行研究有助于人们有针对性的进行防控。【方法】利用组织培养体系，对空心莲子草匍匐茎段进行无菌培养，培养条件主要考虑培养基凝固剂的类型、外植体是否带节、外植体节下茎段长度、外植体扦插方式和扦插深度。【结果】空心莲子草茎段比较理想的组培条件为：带1节长度为4 cm的去叶空心莲子草茎段，使用体积分数75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞浸泡6 min消毒，在MS培养基中连续继代培养，采用第3代无菌苗的茎段作为外植体，在含有普通琼脂的MS培养基（钾离子浓度降至标准培养基60%）条件下，节下部长度为1.5 cm带节外植体正向扦插深度为1.4 cm的时候，可以获得生长良好的空心莲子草植株。实验发现外植体的下部截口上方的茎段能够不经过愈伤组织诱导直接生长出不定根，即出现节间生根现象。外植体培养70 d时，发现有部分不定根出现膨大趋势。继续培养80 d后，笔者观察到空心莲子草不定根出现明显膨大。【结论】研究成功构建了空心莲子草茎段不定根膨大的组织培养体系，为进一步在组培条件下开展空心莲子草贮藏根的形成机理研究提供依据。

空心莲子草；匍匐茎；不定根；组织培养。

【研究意义】空心莲子草［（Mart.）Griseb.］是一种恶性外来入侵植物，其主要入侵地有河流、沼泽、池塘、菜地和农田等水生和陆地环境，对入侵地的生态系统具有严重的负面影响[1-2]。空心莲子草主要通过地上部的匍匐茎和地下茎进行无性繁殖，具有超强的无性繁殖能力[3-4]。在水体中漂浮生长的时候，其匍匐茎节部可产生大量不定根，然而，当空心莲子草匍匐茎的不定根有机会接触到土壤后，其不定根在土壤中可进行不同程度的膨大生长，形成贮藏根[5]，这种贮藏根是陆生型空心莲子草越冬、繁殖和种群扩散的重要保障[6-7]。可见空心莲子草的根系构型随环境条件的变化而变化，研究空心莲子草根系生长发育，尤其是贮藏根的发育，对于揭示空心莲子草成功入侵的机制具有重要作用[8-9]。【前人研究进展】近年来对空心莲子草根系的研究，主要采用茎段扦插盆栽育苗的方法，例如对根系生长动态的研究[6]、环境条件尤其是水分状况对根系发生的影响[8]、外源激素施用对贮藏根生长的研究[10]等，茎段扦插盆栽育苗能够在短时间内获得相对均匀一致的空心莲子草幼苗，为开展系列控制实验打下基础。【本研究切入点】茎段扦插试验存在局限性，例如，难以直接观察植物根系生长情况，在试验中可能受到病虫害和边缘效应的影响等。【拟解决的关键问题】Shekhawat等[11]使用组织培养方法研究了空心莲子草大规模繁殖技术，主要为开展药用化学物质提取做准备，但其操作复杂，成本较高。本文试图利用组织培养体系，寻求一种操作简便，经济有效的空心莲子草茎段组织培养方法，对其根系发育情况进行研究，为揭示空心莲子草的入侵机制和开展入侵防控提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2019年12月23号，在荆州市西郊田间沟渠采集长约4 cm生长健壮的空心莲子草的带节茎段，去叶，清洗干净用流水冲洗30 min后，使用体积分数75%酒精震荡冲洗1 min，再用0.1%升汞进行震荡冲洗6 min消毒，最后用无菌水冲洗5遍，每次冲洗1 min，使用MS培养基进行接种。待外植体萌出1~2 cm的新枝后，将带节新枝切下并接入MS培养基，此为第1代无菌苗；待无菌苗长出3节以上后，切成带一节的含叶茎段接入培养基，此带一节的茎段长成的无菌苗为第2代，依次进行，本试验使用第3代无菌苗作为组培试验材料。

1.2 试验处理

试验设计考虑了多种因素，按单因素设计实验方案。首先降低MS培养基中钾离子浓度（降至标准培养基60%，含硝酸铵1 971 mg/L，硝酸钾1 090 mg/L），培养基的凝固剂分别使用卡拉胶3 g/L和普通琼脂8 g/L；外植体茎段分带节和不带节处理，不带节处理中外植体长为2 cm，接种深度为0.9 cm左右；带节外植体的节下部分设置3种长度，为1.5，0.5，0.1 cm，接入培养基的深度分别为1.4，0.4，0.1 cm；外植体茎段分别进行芽朝上或芽朝下（正插和倒插）方式进行接种；节下部分长度为1.5 cm的外植体接入培养基的深度设置3种处理，为0.4，0.9，1.4 cm。实验所用的器皿为试管(长23 cm，直径为3 cm，容积100 mL)，每支试管均含培养基约60 mL左右，外植体的节上部分长度均为1 cm，节间直径为0.15 cm左右，去掉叶片后保持垂直或略带倾斜接入培养基，每支试管接入外植体（扦插）一个，培养温度为（26±1）℃，光照时长14 h，外植体的地上部分的光照强度为1 600~1 800 lx，地下部分（根系生长部分用泡沫纸板进行遮光）的光照强度为270 lx左右。实验共9个处理，每个处理共10个重复，共培养9×10=90个植株。

1.3 测量方法与数据分析

1.3.1 根系形态分析 在空心莲子草的外植体生长70 d进行取样，根据外植体的成活情况，每个处理取样数为5株，其余外植体继续培养观察。每株空心莲子草从试管中取出并洗净后，统计空心莲子草节间和节处的生根情况（总生根数和直径≥0.15 mm的根数）和叶片数（叶片长度≥0.5 cm的片数），使用游标卡尺（精度0.01 mm）测量直径≥0.15 mm不定根最大横径处的直径、茎段的直径（侧茎由下向上第4至第5节处节间的横径）和长度。使用万深LA-S根系分析独立版植物根系分析仪对根系进行扫描，测量的指标包括节处不定根系的总长度、总体积和总表面积，节间处的不定根的总长度、总体积和总表面积。最后，将每株植株分成茎叶和根分别放入GZX-9140烘箱中，80 ℃下烘干至恒质量（48 h），用电子天平（METTLER TOLEDO PL303-IC（精度0.001））分别称量地上茎叶干质量、根系干质量。试验数据运用WPS和SPSS22.0软件进行数据统计和方差分析，利用单因素分析法（one-way ANOVA）法进行显著性检验。

表1 9个处理的处理方法

2 结果与分析

2.1 空心莲子草匍匐茎段萌发情况

绝大多数的外植体的萌动顺序为侧芽萌发、节间处产生不定根、节处产生不定根，少许外植体侧芽萌动后，先节处产生不定根后节间处产生不定根。除A4处理外，其他处理的空心莲子草茎段（外植体）的节部均能产生不定根；除A3和A6处理外，其它处理的外植体节下部的节间处（以下统称节间）均可生长出不定根（图1），但生长20~25 d后，观察到许多不定根尖端变黑，并停止伸长。外植体节部、节间及截口处均没有产生愈伤组织，绝大多数的外植体节上部逐渐枯萎。可见，在组培条件下，空心莲子草匍匐茎段能够成功萌发植株。

A、B为生长的第14天的A1处理，外植体截口上部（节间处）产生不定根；C为A4处理，外植体不带节，能生长出不定根，但没有产生芽；D为A2处理中，外植体生长产生的空心莲子草；可见外植体节部和节间处均有不定根产生

2.2 不同凝固剂对空心莲子草生长情况的影响

用琼脂作为凝固剂，空心莲子草的不定根总数、节部不定根数、节间处的不定根数显著高于卡拉胶凝固剂处理（0.05），而根冠比则显著降低（<0.05）。琼脂凝固剂处理中空心莲子草地上叶片数、茎段长度、地上干质量高于卡拉胶处理，但差异不显著（>0.05）（表2）。琼脂处理中节间处的不定根有膨大现象发生。这表明，琼脂凝固剂有利于空心莲子草不定根发生，并且有利于诱导不定根的膨大。

表2 不同凝固剂中空心莲子草的生长情况（70 d）

表中数据为平均数±误差，同列后的不同小写字母表示不同处理间差异显著（<0.05）

2.3 外植体的接种方向对空心莲子草生长情况的影响

空心莲子草茎段无论正插还是倒插在培养基上，茎段均能生出侧芽和不定根。倒插方式的外植体节间处没有不定根发生，仅节处能产生不定根，其根系干质量平均为（0.004 7±0.001 6）g/株，显著低于正插的空心莲子草根系干质量（0.006 6±0.000 4）g/株（0.05）。2种接种方式对实验中其余指标没有显著差异（>0.05）。这表明在组培体系中空心莲子草茎段萌发对极性不存在依赖性。

2.4 外植体节下部分茎段的长度对空心莲子草生长的影响

外植体节下长1.5 cm处理（A7）的不定根总数、节部不定根总长度和总表面积、节间处不定根的总体积、根系干质量、叶片数、茎叶干质量、匍匐茎直径和长度都显著高于其他处理（0.05），这些指标随着外植体节下部分茎段长度的增加呈现出递增的趋势。外植体节下部茎段长0.1 cm时，节间处不发生不定根；外植体节下部茎段长0.5，1，1.5 cm处理中，节间处不定根的总体积存在显著差异（0.05），但在数量上没有显著差异（>0.05）（表3)，节间处不定根没有发现膨大现象。由此可见，空心莲子草节下部分长度对其根系和茎叶部分生长具有重要影响。

2.5 外植体节下部分的扦插深度对空心莲子草的生长影响

节下部长度为1.5 cm的外植体，当接入培养基的深度为1.4 cm的时候（A7），节部不定根总长度和总表面积、根系干质量、叶片数、茎叶干质量、匍匐茎的直径和长度显著高于接种深度为0.5 cm处理（A9）（0.05），而根冠比则显著降低（0.05）（表4）。这说明，空心莲子草外植体扦插深度较深时，有利于其根系和地上部分生长。

表3 空心莲子草外植体节下部分茎段的长度对其生长的影响（70 d）

表中数据为平均数±误差，同行后的不同小写字母表示不同处理间差异显著（<0.05）

表4 空心莲子草外植体节下部分的接种深度对其生长的影响（70 d）

表中数据为平均数±误差，同列后的不同小写字母表示不同处理间差异显著（<0.05）

当外植体继续生长的80 d后，即实验处理150 d后观察，发现外植体生出的侧枝上的节间也会产生不定根，不定根出现明显的膨大现象（图2A），在接种深度为0.5 cm的处理中（A9），外植体节部和节间处产生的不定根均具有明显的膨大现象（图2B）。

A为A8处理生长150 d后根系生长情况，节间处不定根明显膨大；B为A9处理生长150 d后根系生长情况，节处和节间处不定根均存在明显的膨大现象

3 讨论与结论

综上所述实验结果，空心莲子草茎段比较理想的组培条件为：带1节长度为4 cm的去叶空心莲子草茎段，使用体积分数75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞浸泡6 min消毒，在MS培养基中连续继代培养，采用第3代无菌苗的茎段作为外植体，在含有普通琼脂的MS培养基（钾离子浓度降至标准培养基60%，含硝酸铵1 971 mg/L，硝酸钾1 090 mg/L）条件下，节下部长度为1.5 cm带节外植体正向扦插深度为1.4 cm时，可以获得生长良好的空心莲子草植株。

已有文献[6,12-13]认为，空心莲子草茎段不定根是从节部发出，实验中，除外植体的节下部茎段长度为0.1 cm和培养基中外植体接种方向为倒插处理外，其他处理中均发现外植体的下部截口上方的茎段能够不经过愈伤组织诱导直接生长出不定根，即出现节间生根现象，节间生根一般早于节部生根。这表明空心莲子草茎段在组培条件下，具有较强的生根能力，不定根发生部位比较广泛。

外植体培养70 d，发现有部分不定根出现膨大趋势。继续培养80 d（共150 d），笔者观察到空心莲子草不定根出现明显膨大。这说明组培条件下，空心莲子草具有膨大形成贮藏根的能力。因此，本实验成功构建了研究空心莲子草茎段不定根膨大的组织培养体系，为进一步在组培条件下开展空心莲子草贮藏根的形成机理提供依据。

植物的根系生长会受到内源激素的影响。内源激素主要由植物的根尖、茎尖和种子等组织进行合成，存在从顶部向基部的极性运输情况[14]，有研究[15]表明植物的茎段中也存在内源激素。在实验中，笔者观察到外植体的侧芽先伸出，然后再产生不定根；倒插时节间发生不定根，不带节外植体的节间处也能生出不定根。这些现象可能与内源激素存在一定关系。空心莲子草幼茎的茎尖能够合成内源激素并将其进行极性运输促使外植体节下部茎段生出不定根，除此之外，空心莲子草的不带节茎段中可能也含有内源激素，从而诱导空心莲子草的节间和节处能够发生不定根。

在盆栽育苗实验中，Dong等[16-17]认为空心莲子草节间长度的增加显著提高了植株的存活率且有利于地上部分的生长（生物量、茎长和叶片数）。组培条件下，也发现外植体节下部长度能显著影响幼苗的生长。一定范围内，节下部越长，越有利于空心莲子草幼苗的生长。其原因可能是空心莲子草茎段也是一个重要的贮藏器官[17-18]，可以储存可溶性碳水化合物和蛋白质[19-20]等营养物质，有利于幼苗的生长。

空心莲子草在组培实验上的成功有助于进一步对其从生理方向进行研究。笔者发现节间处生根现象在空心莲子草中较为普遍，这一发现有助于揭晓空心莲子草的入侵机理，在日后的防治中能够更加精准地对其进行防控。

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Root Development of Stolon Segment ofin Tissue Culture

GUO Yaqi, YAO Zhen, CHEN Zhongyi*

(College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China)

Alternanthera philoxeroides is a worldwide malignant invasive weed. The formation of storage roots plays an important role in its invasion. It is helpful to study the occurrence and expansion of adventitious roots for prevention and control.In this paper, a tissue culture system was used to conduct aseptic culture of the stolon segments of.The culture conditions mainly considered the type of medium coagulant, whether the explants had nodes or not, the length of stem segments under explants nodes, the cutting method and cutting depth of explants.The ideal tissue culture conditions for the stem segments ofwere as follows: with a 4 cm long stem segment and have one node, soaked in 75% alcohol for 1 min, soaked in 0.1% HgCl for 6 min for disinfection, continuously subcultured in MS medium, and the stem segments of the third generation aseptic seedlings were used as explants, in the condition of MS medium containing common agar (potassium ion concentration reduced to 60% of the standard medium), when the length of the lower part of the node was 1.5cm and the forward cutting depth of the explant with node was 1.4cm, the good growth ofcould be obtained.It was found that adventitious roots could grow directly from the stem segment above the lower section of explants without callus induction, that is, the phenomenon of internode rooting appeared. When the explants were cultured for 70 days, it was found that some adventitious roots expanded. After cultured for 80 days, the adventitious roots of Alternanthera philoxeroides were obviously expanded.In this study, the tissue culture system of adventitious root expansion of stem segments of Alternanthera philoxeroides was successfully constructed, which laid a foundation for further research on the formation mechanism of storage roots of Alternanthera philoxeroides under the condition of tissue culture.

Alternanthera philoxeroides; stolon; adventitious roots; tissue culture

S451

A

2095-3704（2021）02-0212-07

2021-05-03

2021-05-25

湖北省自然科学基金项目（2013CFB391）和湿地生态与农业利用教育部工程研究中心开放基金项目（KFT201907）

郭雅琪（1997—），女，硕士生，主要从事植物入侵生态学研究，1207410179@qq.com；*通信作者：陈中义，教授，博士，czy@yangtzeu.edu.cn。

郭雅琪, 姚振, 陈中义. 组培条件下空心莲子草匍匐茎段根系发育的研究[J]. 生物灾害科学, 2021, 44(2): 212-218.