江西地区育龄血红蛋白H患者的基因型与表型分析及产前诊断

罗海艳 陆清 谢康 邹永毅 黄婷 刘艳秋

江西省妇幼保健院产前诊断中心（南昌330006）

地中海贫血（地贫）是一种高发于中国南方地区的血液系统常染色体隐性疾病，主要类型有α-地贫和β-地贫［1-2］。根据受累的α-珠蛋白基因个数，可将α-地贫分为静止型、轻型、中间型和重型四类。血红蛋白H（HbH）病是一组中间型α-地贫，患者由于缺失3 个α-珠蛋白基因或因缺失2 个α-珠蛋白基因且复合α-珠蛋白基因非缺失突变导致α-链合成显著减低，多余的β-链聚合为四聚体（β4）即HbH。四聚体易解离并沉积形成包涵体，引起红细胞破坏发生慢性溶血性贫血，是可存活的α-地贫中最严重的一种［3-5］。HbH 病是一种分子遗传学机制异质性较大的疾病，其基因变异类型与频率存在着明显的种族与地域差异［6-7］。此外，HbH 患者临床表型个体差异较大，贫血程度各异，通常表现为轻度至中度贫血，轻者血红蛋白可为正常，重者可出现肝脾肿大、骨骼畸形与发育异常，甚至需依赖输血维持生命［8］。目前，在我国一些地贫高发省份如广西、广东、海南等，已有不同人群HbH 病基因型频率以及血液学特点相关研究，为当地的地贫遗传咨询与出生缺陷防控提供依据［9-11］。江西地区地处中国南方，是国家地贫防控的重点区域，目前尚缺乏该地区HbH 病的基因型频率与临床表型相关研究。本研究对江西地区育龄人群HbH 患者的基因型及血液学表型进行分析，同时为符合地贫产前诊断指征的HbH 患者提供产前诊断，不仅可为江西省HbH 病的临床遗传咨询提供指导，对出生缺陷防控的实践也具有重要参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择自2017年3月至2019年12月在江西省妇幼保健院就诊的育龄受检者9 883 例（年龄18 ～46 岁），研究对象主要来自于常规体检、孕前检查、产前检查、优生遗传咨询、辅助生殖术门诊，所有受检者均否认近1年内有输血史，所有检测均获得受检者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血常规检测采用迈瑞2000 血液分析仪分析患者血红蛋白（hemoglobin，Hb）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均血红蛋白含量（mean corpuscular volume，MCH）等参数。成人MCV 参考区间为82 ～92 fL，MCH 参考区间为27 ～31 pg。当男性Hb ＜120 g/L 或女性＜110 g/L，MCV ＜82 fL 或/且MCH ＜27 pg 时可判断为小细胞低色素性贫血。

1.2.2 血红蛋白电泳检测采用法国Sebia 公司生产的CAPPILLARY S2 FLEX PIERCING 全自动毛细管电泳仪及配套试剂行血红蛋白电泳检测，分析患者HbA2、HbH、Hb Bart′s 带含量，成人HbA2值的参考区间为2.2%～3.5%。

1.2.3 介入性产前诊断穿刺于合适孕周在B 超引导下行介入性穿刺术采集胎儿标本，排除胎儿标本中母体细胞污染后行地贫基因检测。绒毛膜穿刺术的适用孕周为11 ～13+6周，羊膜腔穿刺术为18 ～28 周，脐带血穿刺术为＞28 周。

1.2.4 外周血及羊水gDNA提取严格按照Qiagen血液组织DNA 提取试剂盒（Qiagen，德国）说明书提取外周血与羊水细胞gDNA，使用微量紫外分光光度计（Nanodrop 2000）测定DNA 浓度并调节浓度至50 ～100 ng/μL 备用。

1.2.5 常规地贫基因检测使用Gap-PCR 结合琼脂糖凝胶电泳的方法检测α-珠蛋白基因3 种常见缺失（--SEA/、-α3.7/、-α4.2/），采用PCR 结合反向斑点杂交法（DOT-RDB）检测α-珠蛋白基因的3 种常见点突变（αWSα/、αCSα/和αQSα/）及β-珠蛋白基因的17 种常见点突变，即CD41-42（-TTCT）、CD43（G→T）、IVS-II-654（C→T）、-28（A→G）、-29（A→G）、-30（T→C）、-32（C→A）、CD71-72（+A）、βE（GAG→AAG）、CD17（A→T）、CD31（-C）、CD14-15（+G）、CD27/28（+C）、IVS-I-1（G→C）、IVS-I-5（G→C）、CAP（-AAAC）和IntM（ATG.→AGG），PCR 反应体系及扩增条件严格按照试剂盒（亚能生物技术公司，深圳）进行操作。

1.2.6 罕见地贫基因检测对经血红蛋白电泳提示HbH 带而常规地贫基因检测为非HbH 基因型的患者，行进一步罕见地贫基因检测。使用Gap-PCR 结合琼脂糖凝胶电泳检测HKαα、--THAI（泰国型）、anti4.2、-α27.6、-α21.9、α fusion gene（α融合基因）等罕见α-地贫，检测试剂盒购自深圳亚能生物技术有限公司。使用PCR 结合Sanger 测序的方法检测α2 与α1 基因上的罕见点突变或新突变，引物序列参照徐湘民《地中海贫血预防控制操作指南》［12］。

1.3 妊娠结局随访对行产前诊断的孕妇行妊娠结局随访，对出生的新生儿定期行血常规结果随访。

1.4 统计学方法采用Microsoft Excel 2003 软件对基因型与血液学检测结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 江西地区育龄HbH患者基因型分析9 883例育龄受检者中共检出34例HbH患者，共计8种基因型，检出率为0.34%（34/9 883）。其中缺失型HbH患者31例（91.2%），非缺失型HbH患者3例（8.8%）。按是否合并β-地贫，可将缺失型HbH 患者分为单纯性HbH 病与合并β-地贫HbH 病两类。其中单纯性缺失型HbH 患者共28 例，19 例基因型为-3.7α/--SEA（67.9%），9 例基因型为-4.2α/--SEA（32.1%）；合并β-地贫缺失型HbH 病患者3 例，其基因型分别为-3.7α/--SEA 合并β-地贫CD41-42 杂合突变，-3.7α/--SEA 合并β-地贫IVS-II-654 杂合突变，以及αQSα/--SEA 合并β-地贫CD41-42 杂合突变。3 例非缺失型HbH 患者基因型分别为αWSα/--SEA，CSα/--SEA 与国内首次报道的非缺失型αCD61（AAG ＞TAG）α/--SEA，江西地区34 例育龄HbH 患者的基因型分析见表1。

表1 江西地区34 例育龄HbH 患者的基因型构成及频率Tab.1 Genotypes and frequency of 34 patients with HbH disease in Jiangxi province

2.2 34例HbH患者血液学表型分析血常规结果显示34 例HbH 患者均表现出小细胞低色素的血液学特点，MCV与MCH参数较参照值相比明显降低，其MCV值为（62.61±9.86）fL（范围为48.3 ～71.6 fL），MCH 值为（17.4 ± 2.1）pg（范围为13.8 ～21 pg），不同基因型之间MCV与MCH值存在一定差异。34例HbH 患者除1 例HbH-WS 女性Hb 值正常外，其余33 例HbH 患者贫血程度表现出个体差异，其Hb 值介于71 ～117 g/L之间，呈轻度贫血者12例（36.4%），呈中度贫血者21 例（63.6%）。血红蛋白电泳结果显示31 例单纯性HbH 患者HbA2 值降低，为（1.35±0.25）%，范围为0.7%～1.8%，表现出α-地贫血液学特点，而3 例合并β-地贫HbH 患者经血红蛋白电泳检测HbA2 值均升高（＞3.5%），仅表现出β-地贫的特点而掩盖了α-地贫的血液学特征。34 例HbH患者中仅有30例经血红蛋白电泳出现HbH带，其含量为（6.8±1.2）%，范围为2.1%～11.9%，4例未出现HbH 条带的患者分别为WS-HbH 病1 例，合并β-地贫HbH 病3 例；仅23 例患者经血红蛋白电泳出现Hb Bart′s 带，其含量为（1.0 ± 0.1）%，范围为0.3%～2.0%；HbH 与Hb Bart′s 条带的含量未表现出与基因型或贫血程度的明显相关性。对同一基因型的HbH 患者而言，整体上女性Hb 值明显低于男性，贫血程度比男性严重，这可能与女性的妊娠或营养等生理状态相关；而相同HbH 基因型的女性患者与男性患者相比，其MCV 值、MCH 值及HbA2值与性别无明显相关性。由于本研究中不同基因型的育龄HbH 患者病例数差异较大，未对不同基因型之间的血液学表型差异行统计学分析。34 例HbH 患者的基因型及相关血液学表型详见表2。

表2 34 例HbH 患者的基因型与血液学表型Tab.2 Genotypes and hematological parameters of 34 patients with HbH disease

2.3 HbH患者产前诊断结果分析对34例HbH 患者的配偶行地贫基因检测，发现有5 对夫妻为同型地贫携带者，3 对为同型α-地贫携带者，2 对为同型β-地贫携带者，符合地贫产前诊断指征。产前诊断结果显示1 例胎儿为Hb Bart′s 水肿胎，其基因型为--SEA/--SEA，1 例胎儿为重型β-地贫，其基因型为βIVS-II-654β-28，1 例胎儿为缺失型HbH 病，其基因型为-3.7α/--SEA，其余2 例胎儿分别为α-地贫与β-地贫携带者，5 个行地贫产前诊断的家系信息及产前诊断结果见表3。

表3 行地贫产前诊断的5 个家系Tab.3 Five families with prenatal diagnosis of thalassemia

2.4 妊娠结局随访家系1 与家系2 中的2 例孕妇选择终止妊娠，其余3 个家系选择继续妊娠。胎儿出生后进行随访，3 例胎儿均足月顺产，阿氏评分为10 分。家系3 中胎儿6月龄血常规结果示Hb 值为107 g/L，MCV 为72 fL，MCH 为24 pg，呈轻度小细胞低色素贫血，家系4 中胎儿6月龄体检时血常规结果未见异常，家系5 中胎儿6月龄体检时血常规结果示Hb 值为120 g/L，MCV 为70 fL，MCH为25 pg，仅表现出小细胞低色素而无贫血的血液学特点。后期将对上述5 个家系继续随访。

3 讨论

地中海贫血是一种随地理区域与种族不同而存在明显基因型差异的疾病，HbH 病作为一种可存活的最严重的α-地贫，在不同的α-地贫高发地区具有其独特的发生率与基因突变谱。此外，HbH 病分子基础异质性高，不同基因型的个体、相同基因型的不同个体、甚至同一个体在不同阶段的贫血程度均有较大差异，这给临床遗传咨询带来了很大的困难。江西省位于中国南部，是国家地贫防控的十个重点省份之一。HbH 病在该地区人群中也有一定的发生率［13］，但目前尚缺乏关于该地区HbH 病的基因型频率与血液学分析的研究，因此对该地区育龄人群进行HbH 病的基因检测与遗传咨询至关重要。

本研究针对9 883例大样本量的育龄受检者进行地贫基因检测，检出江西地区育龄人群HbH病的发生率约为0.34%（34/9 883）。与广西［9］、广东［14-15］、海南［16］、云南［17］等地的发生率相比，明显低于上述几个区域。在基因型频率方面，江西省缺失型HbH病-α3.7/--SEA 与-α4.2/--SEA 所占比例明显高于非缺失型，与相邻的广东与福建两省相似，而与广西地区差异较大。在黄雅莉等［18］关于广东湛江地区HbH 病的研究中，该地区缺失型HbH 频率均高于非缺失型HbH；在付春云等［19］对广西地区HbH病的研究中，最常见的基因型为-α3.7/--SEA，其次为αCSα/--SEA，非缺失型αCSα/--SEA 发生率高于缺失型-α4.2/--SEA。此外，江西地区也具有其独特的HbH病基因突变谱，如本研究中检出了目前国内尚未报道过的αCD61（AAG＞TAG）α/--SEA 基因型。随着后续样本量的扩大，可能检出更多具有地区特异性的HbH 基因型。

以往研究［20］认为，基因型为-α3.7/--SEA 或-α 4.2/--SEA 的个体，临床表现呈轻度到中度贫血，而基因型为αCSα/--SEA、αQSα/--SEA 的个体较-α3.7/--SEA 及-α4.2/--SEA 个体相比可表现为更严重的贫血，对于基因型为αWSα/--SEA 的个体，虽然为3 个α-基因受累的HbH 病类型，但此类患者一般不贫血或仅为轻度贫血。在本研究中，除1 例αWSα/--SEA女性HbH 患者Hb 值正常，其余患者均由基因型、年龄、性别等因素不同而表现出不同程度的小细胞低色素贫血，与既往研究中HbH 患者的临床表型相似。33 例有贫血表型的HbH 患者中，轻度贫血者12 例（36.4%），中度贫血者21 例（63.6%），表明在育龄人群HbH 患者的贫血程度主要为中度贫血，少部分表现出轻度贫血。对同一HbH 基因型的患者而言，整体上女性贫血比男性严重，可能与女性的特殊生理因素或妊娠因素有关。此外，单纯性HbH 患者HbA2 值降低（＜2.2%），表现出α-地贫特点，而合并有β-地贫的HbH 患者HbA2 值升高（＞3.5%），仅表现出典型的β-地贫而掩盖了α-地贫血液学特征。这提示了对血液学提示HbA2 值升高的受检者，一定要同时检测α-地贫避免漏检；30 例HbH 患者经血红蛋白电泳后出现HbH 带，4例HbH者电泳后未出现HbH带。4例未出现HbH条带的患者中，1 例WS-HbH 患者由于未表现出贫血而无HbH 条带，3 例合并β-地贫的HbH 患者可能由于携带了β-地贫而导致β4 聚合体含量降低，血红蛋白电泳后未出现HbH 条带。这提示基于HbH 条带等血液学指标筛查HbH 病可能存在漏检，其诊断需依赖基因检测。临床上，HbH 患者的配偶必须行地贫基因检测，因为仅通过筛查配偶血常规与血红蛋白电泳无法评估该家庭生育严重HbH 患儿的风险。本研究中行产前诊断的5 个家系中，胎儿为重型α-地贫与重型β-地贫的两个家庭选择了终止妊娠。胎儿基因型为-α3.7/--SEA 的家庭在充分知情前提下，选择继续妊娠，建议父母对其定期行血常规检查监测贫血并特殊护理，以及成年后婚育时进行遗传咨询。其余2 例胎儿为α-与β-地贫携带者的家庭，建议其成年后婚育时进行遗传咨询。

本研究仍然存在一定的局限性。首先，要系统地对江西地区育龄HbH 患者进行基因型频率分析，尚有待更大规模受检者样本量的积累；其次，在检测方法上，采用高通量捕获测序（next generation sequencing，NGS）结合Gap-PCR 可更有效地检测出罕见HbH 病，而在本研究中，仅基于患者血红蛋白电泳出现HbH 带的血液学特点时，才对受检者行罕见地贫基因检测，可能存在漏检罕见HbH患者的情况。

综上，本研究首次报道了江西地区育龄HbH患者的发生率与基因型构成及临床表型，发现了目前国内尚未报道过的αCD61（AAG＞TAG）α/--SEA 基因型，丰富了江西地区地中海贫血的基因突变谱；同时为有生育中、重型地贫患儿的家庭提供产前诊断，为育龄人群HbH 病的遗传咨询及后续产前诊断提供了重要的参考价值，对完善出生缺陷防控具有重要意义。