电感耦合等离子体质谱法在不同药典中的方法体系和在中药无机成分研究中的应用进展

李丽敏，周如洁，曹帅，毛秀红，胡青，季申

(1.上海市食品药品检验研究院,上海 201203;2.国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室,上海 201203)

电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是20世纪80年代迅速发展起来的一种元素检测方法,其以独特的接口连接电感耦合等离子体(ICP)源与质谱(MS)仪,具有动态线性范围宽、干扰少等优势,可同时进行多元素测定和同位素分析,灵敏度、准确度、精密度均优于原子吸收光谱法(AAS)等传统元素分析法[1],在地质、环境、食品及生命科学研究中应用广泛[2-4]。

为满足药品中杂质元素的分析需求[5-6],国内外药典均收录了ICP-MS,包括其通则方法、检测方法、技术要求或指导原则。药典收录的ICP-MS主要关注有害杂质元素的分析,但ICP-MS在中药中的应用还包括有效性物质和产品内在质量影响因素的探究,如微量元素、稀土元素的分析及元素形态及价态的研究等,因此本工作介绍了ICP-MS在中国、美国及欧洲药典中的方法体系及应用,并对中药中无机元素分析领域的研究热点和进展进行总结,对其应用前景进行展望,旨在为中药安全标准制定、中药安全性和有效性评价等提供参考。

1 国内外药典中关于ICP-MS的介绍

《中华人民共和国药典》(2020版)(ChP 2020)四部通则0412,《美国药典》(USP 43)＜730＞和《欧洲药典》(EP 10.0)2.2.58中均收载了ICP-MS通则方法[7-9]。通则方法对仪器及测定的基本要求均做了详细的阐述,但内容侧重点和具体要求有一定差异。USP 43和EP 10.0均明确列出了ICP-MS的方法学验证或确认的技术要求,而Ch P 2020 则从仪器基本配置、仪器分析流程、干扰消除、标准曲线和定量方法与方式等方面分别介绍了ICP-MS(测定元素总量)和高效液相色谱-ICP-MS(HPLC-ICPMS,测定元素形态)等两种方法,3种药典的简要介绍见见表1。其中Ⅰ*代指药物或制剂常量成分含量的测定;Ⅱ*代指痕量杂质的含量或限量的测定。

表1 不同药典中ICP-MS通则方法主要内容的比较Tab.1 Comparison of main contents of ICP-MS general method reles in different pharmacopoeias

1.1 ChP 2020

ChP 2020以0412通则方法为基础形成了相应的方法体系(图1),主要为中药中重金属及有害元素的总量及其形态的研究提供方法指导:①“四部”通则2321铅、砷、镉、汞、铜测定法将ICP-MS作为推荐方法之一,规定了ICP-MS测定中药中重金属及有害元素的分析参数和步骤,为“一部”中黄芪等41种中药以及“四部”注射剂通则的中药注射剂中的重金属及有害元素的分析提供方法依据;②“四部”通则9304为ICP-MS测定中药中铁、铬、铝、钡等元素的指导原则,能为中药的非法掺杂和非法增重情况的监测提供技术依据,将该方法与“四部”通则2321合并,能同时测定中药中的9种元素,提高中药安全性监测筛查范围和效率;③“四部”通则2322为HPLC-ICP-MS分析汞和砷元素形态及价态的方法,该方法列出了二价汞、甲基汞、乙基汞等3种汞元素形态,以及砷胆碱、砷甜菜碱、三价砷、一甲基砷、二甲基砷和五价砷等6种砷元素形态的仪器分析参数及分析程序,并针对动植物药和矿物类中药等分别列出了供试品前处理的参考方法;2322通则方法用在ChP 2020“一部”矿物药朱砂和雄黄二价汞和无机砷检查项中,用于含有毒元素矿物安全性评价指令的安全监控。

图1 ChP 2020中ICP-MS方法体系及其应用Fig.1 Method system and application of ICP-MS in ChP 2020

此外,ChP对于ICP-MS在药用辅料和生物制品中杂质元素测定方面也有应用,2020年版“四部”辅料明胶空心胶囊质量标准中铬(Cr)检查项中新增了ICP-MS测定法,通则生物制品相关检查方法3208新增了ICP-MS测定人血白蛋白铝残留量的方法。

1.2 USP 43

USP 43中＜730＞等离子体光谱法的通则方法收载了ICP-MS和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES),方法体系介绍见图2。USP 43中ICP-MS主要应用在药品元素杂质限量控制、植物药和膳食补充剂重金属及有害元素污染控制等方面。

图2 USP 43中ICP-MS的方法体系及其应用Fig.2 Method system and application of ICP-MS in USP 43

USP 43中＜232＞元素杂质限量参照了人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)Q3D元素杂质指导原则,按照元素毒性和药品剂型,以每日允许最大暴露量(PDE)为依据,列出了不同剂型原料药及制剂中24种元素杂质的参考限量,主要适用于化学原料药、辅料及制剂等类型药品的元素杂质控制,但对植物药、放射性药等不适用。USP 43 中＜233＞元素杂质测定中列出ICP-AES和ICP-MS两种方法,其中“分析方法2”ICP-MS以＜730＞通则方法为基础,列出杂质元素分析条件、供试品及对照品溶液的制备方法和测定程序及要求等详细内容,同时对其方法学验证内容和技术要求均做了详细的规定。USP 43中＜2232＞膳食补充剂的元素污染物检查项以ICP-MS通则方法为基础,列出了ICP-MS分析无机砷和HPLC-ICP-MS分析甲基汞的具体方法,可为元素杂质的形态分析和限量标准制订提供参考。

USP在对植物药及膳食补充剂的污染物限量进行规定时考虑了砷、汞元素形态及价态限量,其中USP 43中＜561＞规定了植物药中砷(无机砷)、镉、铅、总汞及甲基汞的限量,＜2232＞规定了膳食补充剂中无机砷、总汞、铅、镉和甲基汞的限量,这些元素的检测和方法验证均要遵循＜233＞的技术要求,元素形态及价态可参照＜2232＞列出的无机砷和甲基汞方法。

1.3 EP 10.0

EP 10.0中2.2.58的ICP-MS通则方法(图3),可为药品元素杂质限量的控制和植物药重金属限量控制方法的建立提供依据。EP 10.0中5.20杂质元素限量直接引用ICH Q3D 元素杂质指导原则,2.4.20元素杂质测定不仅为5.20提供系统的方法策略和要求,还详细介绍了杂质元素分析的样品制备、方法选择和方法学验证内容和要求,杂质元素的测定方法包括ICP-MS、ICP-AES、AAS、AES和X 射线荧光光谱法(XRFS)等,其中ICP-MS 以2.2.58通则方法为基础。

图3 EP 10.0中ICP-MS方法体系及其应用Fig.3 Method system and applicationof ICP-MS in EP 10.0

由于EP 10.0中杂质元素限量标准不适用于植物药,EP 10.0在专门的草药章节中规定了草药中镉、铅、汞等重金属元素的限量,并在2.4.27中给出了草药和草药制剂中重金属元素的检测方法,其中前处理方法推荐使用微波消解法,测定方法列出了AAS、ICP-AES和ICP-MS(也以2.2.58通则方法为基础)等3种方法,其中ICP-MS列出了砷、镉、铜、汞、镍、铅测定时的推荐同位素和系统适用性要求,同时还详细给出了方法学验证要求,包括专属性、检测范围、准确度、重复性、中间精密度、定量限和检出限等,比2.2.58的验证内容更详细。

目前,国内外药典对于药品中(包括中药或植物药)杂质元素或污染物限量的要求已由控制杂质元素总量转变为关注单个元素危害,故对检测方法的专属性和灵敏度要求更高。以ICP-MS通则方法为基础建立的方法体系,如微波消解结合ICP-MS,已成为中药重金属及有害元素研究的主要分析手段[10-11],且随着ICP-MS的应用,其检测对象已逐渐扩展到更多的无机元素[12-14]和基质种类[15-17],已成为中药元素杂质安全性和无机元素有效性研究的重要工具,可为相关标准的研究与建立提供方法依据。

2 ICP-MS在中药无机成分研究中的应用进展

中药包括植物药、动物药和矿物药,其中含有丰富的无机元素,由于受环境影响较大,呈现分布复杂及安全风险高等特点。ICP-MS 具有高通量、高灵敏及联用接口普适性等优势,可用于研究中药无机成分及其与安全性和有效性的密切关系。

2.1 中药安全性评价及风险评估

以ICP-MS研究中药重金属及有害元素含量,并同已有标准规定进行比较,有助于发现污染风险高的品种[16-19],能为中药风险监测和监管提供参考。以ICP-MS结合统计学软件研究重金属及有害元素与中药产地、炮制工艺及生长时间的相关性,可为中药质量评价提供依据。左甜甜等[20]以ICP-MS结合化学计量学对不同产地枸杞中铅、砷、镉、汞、铜进行了多元统计分析,用于枸杞子药材的道地性和安全性的评价。柳臻等[21]根据ICP-MS 研究的何首乌、白芍、当归、川乌等生品和炮制品中铬、铜、铅、锌元素的变化规律,探究了炮制过程中可能影响重金属及有害元素变化的主要因素。朱晓东等[22]以ICP-MS结合化学计量学对青翘与老翘中铅、砷、汞、镉、铜、铬等元素进行了统计分析,研究了连翘中的元素随着生长时间延长的变化规律,可为连翘质量分级提供依据。

利用ICP-MS获得的大数据,还可进行安全性风险评估(如暴露、致癌/非致癌风险评估),能为中药对人体健康的风险评价和其中重金属及有害元素限量标准的制订提供依据[23]。LUO 等[24]采用ICP-MS测定了全球86 种共1 773 批中药材中的铅、砷、镉、汞、铜含量,经暴露评估和非致癌风险评估后发现其中25种中药材中重金属元素含量超出了可接受范围,由于砷的危险指数和致癌风险均最高,提出应结合不同砷价态进行深入研究。YANG等[25]采用ICP-MS测定249种共计10 245批次中药材中铅、砷、镉、汞含量,并采用聚类分析对超标药材的风险程度进行分类,结果显示:狗脊、卷柏、白及等5种中药材具有较高的铅污染风险;昆布等3种中药材具有砷污染风险;通草等6种中药材具有镉污染风险;干漆有汞污染风险;岗梅等6种中药材具有非致癌风险。

针对中药服用特点,采用ICP-MS对中药中重金属及有害元素的转移率和生物可及性转移率进行研究,可进一步为中药健康风险评价提供依据[26-29]。另外,有研究者基于ICP-MS结果进行了大数据分析和风险评估,筛选出了具有高风险、高蓄积特性的中药材,开展了其中重金属及有害元素的含量与土壤关联性研究,以此揭示这些元素的富集特性及蓄积机制[30-31],可为中药种植环境、种质选择、优化生产等奠定基础。

2.2 无机元素谱及质量评价

微量元素与动植物生长密切相关,对动植物药效的发挥起重要作用。动植物从自然界汲取养分,其药材中的微量元素种类及含量和环境等因素密切相关。ICP-MS可用于监测多元素含量特征,以此形成的无机元素谱能全面直观体现中药中无机元素种类和含量变化,因此,可采用ICP-MS监测和评价中药的质量。程益清等[32]以ICP-MS 研究了中药注射用血塞通从原料到制剂的整个生产环节中35种元素的迁移规律,可为制剂工艺和产品质量监控提供参考。卢森华等[33]采用ICP-MS 测定了强力枇杷露中20种无机元素,运用主成分分析明确了特征元素,并用建立的模型对中药制剂产品质量进行了评价。刘圣金等[34]对治糜康栓中18种无机元素特征进行了研究,筛选出12种可对正品和伪品进行甄别的差异元素,用于对中药制剂掺伪的监控。

中药材生长受地域、环境、气候的影响较大,其中的无机元素与产地密切相关且具有种属差异。通过统计学对ICP-MS获得的无机元素谱的多变量大样本进行数据分析,能较好地揭示特征元素与药材产地的内在联系,在道地药材识别方面具有良好的应用前景。ZHAO 等[35]以ICP-MS测定不同产地栽培的远志药材中的15种微量元素,通过雷达图、元素指纹谱和层次聚类分析、主成分分析、判别分析等多元数据统计实现了4个不同产区药材的有效识别。MA 等[36]采用类似方法鉴别了不同产地的3个麻黄种属。DU 等[37]基于元素分析稳定同位素比质谱法和ICP-MS结果,采用层次聚类分析法,较好地区分3个产区的黄连,并利用逐步线性判别分析法(SLDA),建立了用于区分3 个产区物种的分类模型,利用正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)实现了药材真伪的鉴别。

2.3 有害元素形态及价态

元素的生理活性和生物毒性与其形态及价态密切相关,同一元素的不同形态及价态对人体健康具有不同的影响,如三价砷比五价砷更容易与蛋白质中的巯基结合,其毒性较大,甲胂酸和二甲胂酸具有中等毒性,动植物中的砷甜菜碱和砷胆碱几乎无毒性[38-39];甲基汞、四乙基铅等有机态比其对应的无机态毒性强[40-41]。因此,如果仅用元素总量进行中药风险评估,往往会高估其对人体的危害,从而导致药物被不合理地限制应用。HPLC-ICP-MS已作为成熟技术用于汞、砷元素形态及价态分析,已被Ch P和USP收录,不仅可为中药科学合理的评价提供依据,还可为元素毒性迁移及转化规律的研究提供手段。

李耀磊等[42]在研究冬虫夏草中的有害元素与其产区土壤的污染水平时发现,冬虫夏草具有富集砷的特性。XIAO 等[43]在以ICP-MS 和HPLCICP-MS对野生冬虫夏草中的砷总量、形态和分布研究时发现,毒性较大的无机砷仅占总砷含量的4%～11%;骆骄阳等[44]采用HPLC-ICP-MS 测定了31种动物药中砷、汞元素形态残留,确定了动物药中残留的具有中高风险的砷、汞的元素形态及含量,可为动物药的安全风险评估及限量标准的制定提供参考。LI等[45]建立了HPLC-ICP-MS测定矿物药青礞石和动物药地龙中6价铬含量的方法,可为中药中铬元素形态的研究提供参考。

矿物药在我国已应用千年,其中含有大量的各种形态的重金属元素,如以朱砂、雄黄为代表的矿物药含有大量的汞或砷元素,朱砂的主要成分为硫化汞(HgS),雄黄的主要成分为四硫化四砷(As4S4)。由于国际法规对重金属及有害元素总量的限制,使其应用倍受质疑。本课题组以仿生法提取雄黄、朱砂及其制剂中的可溶性砷、汞,采用HPLC-ICP-MS分析了砷、汞元素形态[46],可为含砷、汞矿物药及其制剂质量的合理评价提供科学的方法[47-48]。HPLC-ICP-MS还可用于对含砷、汞矿物药的体内元素形态吸收、代谢、分布等研究,从而揭示传统中药增效解毒的机理及指导人们合理用药。YI等[49]以HPLC-ICP-MS研究雄黄给药后大鼠体内砷的吸收、分布及砷形态的变化,发现雄黄中的可溶性砷被大鼠吸收后,其体内含有丰富的二甲基砷,肝、肾含有一甲基砷,肝、肾、脑也有无机砷的分布,血清中砷消除速率较慢,为临床用药提供了参考。张庆丽等[50]和王启铮等[51]分别研究了给药后的比格犬和大鼠体内六神丸和雄黄中砷元素形态的组织分布变化,并进行了药动学研究,发现六神丸中的配伍对雄黄中砷具有减毒作用;姜新等[52]采用HPLC-ICPMS对大鼠口服纳米雄黄后的砷元素形态分布进行了研究,发现纳米雄黄可提高砷的生物利用度,但其毒性相较传统水飞雄黄也同时增加。

3 总结与展望

ICP-MS作为被药典收载的方法,不仅有助于中药重金属及有害元素的安全性研究,还可进一步推动其在中药无机元素谱和元素形态及价态方面的研究,为中药产地溯源、工艺监测及质量评价等提供科学指导。中药含有的无机元素与天然有机化合物相辅相成,如能将无机元素谱和有机成分指纹谱进行关联性研究,将能挖掘更多可用于中药物质基础研究的信息。金属组学是一门极具潜力的分析学科,正逐渐被中药研究者所接受,这对于中药安全性、有效性及相关机理的探讨具有重要意义[53]。

ICP-MS技术具有较强的拓展性,新技术和新方法正在不断地被开发应用,如:单颗粒ICP-MS(SP-ICP-MS)已经实现对部分金属元素纳米颗粒的测定[54];激光剥蚀作为ICP-MS 的进样系统,已用于生物或组织的元素质谱成像研究[55-56];HPLCICP-MS已经向多元素形态及价态分析方向拓展[57]。这些技术或将为中药物质基础、有效性和安全性研究开辟新领域。