piR-10555对心肌细胞坏死的调控作用及其机制

王凯 王飞 陈鑫哲 周露玙

(青岛大学转化医学研究院，山东 青岛 266021)

心血管系统疾病具有高发病率及高死亡率的特点[1]，而且患者发病愈来愈年轻化，对人类的生命健康造成了严重威胁[2]。急性心肌梗死是心血管疾病中较为严重的一种，早期诊断和及时治疗是临床的迫切需要。心肌梗死主要是突发的持续性缺血缺氧所导致。发生心肌梗死的时候会损伤大量的心肌细胞[3]。同时每年由于人体正常的新陈代谢与老化，心肌细胞也会出现持续性的损失[4]，因此针对心肌细胞坏死机制的研究显得非常重要。

2006年ARAVIN等[5]从C57小鼠输精管中分离出一种新型非编码小RNA，并发现其可以与PIWI亚家族蛋白发生互作，遂将此类小RNA命名为piRNA。piRNA 3′端存在甲基化修饰，5′端第一个核苷酸存在尿嘧啶偏向性，同时第10位的碱基存在腺嘌呤偏向性[6]；piRNA通过DNA甲基化沉默转座子，在生殖系统中表达水平很高[7]；piRNA主要分布在常染色体上，极少一部分分布于X、Y染色体上[8]。随着研究的不断深入，发现piRNA在细胞衰老、心血管系统疾病、癌症等众多疾病中均扮演着重要的角色[9-11]。最近研究发现，piRNA可以通过介导mRNA表观遗传修饰参与调节心肌肥厚的发生发展过程[7]。但目前对于piRNA在心肌细胞坏死过程中的作用机制尚不清楚。piR-10555已被现有基因库收录，编号DQ542443。本研究通过过表达或敲低H9c2细胞piR-10555基因，探讨piR-10555在H9c2细胞坏死过程中变化情况及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂来源

大鼠心肌细胞H9c2为本实验室保存；逆转录试剂盒、SYRB试剂盒购自宝日医生物技术有限公司；转染试剂购自美国赛默飞世尔科技公司；siRNA及阴性对照NC购自吉玛制药技术有限公司；LDH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞培养与处理

1.2.1细胞培养 将H9c2细胞置于体积分数为0.10血清及10 g/L的青链霉素混合液的DMEM培养基中，于37 ℃、含体积分数0.05的CO2条件下传代培养。选取对数生长期、生长良好的细胞，接种于培养板中，孵育12～48 h后，用于后续实验。

1.2.2细胞坏死诱导处理 以500 μmol/L H2O2处理H9c2细胞0、6、12、24 h，具体实验步骤参考文献进行[12]。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法筛选出H9c2细胞piR-10555表达差异有显著性的时间点作为后续实验的处理时间。

1.3 实验分组及处理

本研究通过分别向细胞不转染、转染NC以及转染agomir-piR-10555将细胞分为正常对照组(A组)、NC组(B组)、过表达piR-10555组(C组)。使用RT-qPCR方法检测各组细胞中piR-10555的相对表达水平(U6作为内参照)，通过PI染色及LDH试剂盒测量各组细胞的坏死情况,实验操作均严格按照试剂盒说明进行。实验重复3次，结果取均值。

通过分别向细胞不转染、仅H2O2处理以及转染NC后H2O2处理、转染antagomir-piR-10555后H2O2处理将细胞分为正常对照组(D组)、H2O2处理组(E组)、NC+H2O2处理组(F组)以及敲低piR-10555+H2O2处理组(G组)。使用RT-qPCR方法检测4组细胞中piR-10555的相对表达水平(U6作为内参照)，通过检测PI阳性染色比例及细胞培养基上清液中LDH的活性来测量细胞坏死情况，实验操作均严格按照试剂盒说明进行。实验重复3次，结果取均值。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 H2O2处理的不同时间点H9c2细胞中piR-10555的表达情况

RT-qPCR检测结果显示，H2O2处理H9c2细胞0、6、12以及24 h后，piR-10555表达水平分别为1.00±0.23、1.27±0.27、1.75±0.64、2.91±0.25，不同时间H9c2细胞中piR-10555表达差异有显著性(F=14.51，P<0.05)；其中24 h与0 h进行比较，H9c2细胞中piR-10555表达水平具有显著性差异(P<0.05)。

2.2 piR-10555对H9c2细胞坏死的调控作用

2.2.1过表达piR-10555对H9c2细胞坏死的影响实验结果显示，各组H9c2细胞中piR-10555表达水平、PI阳性率及细胞培养基上清液中LDH活性比较差异有显著性(F=32.61～154.00，P<0.05)，其中C组以上指标与A、B组比较，差异均有显著意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 过表达实验各组H9c2细胞内piR-10555表达水平及细胞坏死情况比较

2.2.2敲低piR-10555对H9c2细胞坏死的影响敲低实验结果显示，各组H9c2细胞中piR-10555表达水平、PI阳性率及细胞培养基上清液中LDH活性比较差异具有显著性(F=33.31～138.70，P<0.05)，其中G组与E、F组比较，差异均有显著意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 敲低实验各组H9c2细胞内piR-10555表达水平及细胞坏死情况比较

3 讨 论

心肌细胞的死亡是许多心脏疾病的病理学基础[13]。长期以来坏死被认为是细胞死亡的最主要的方式之一。过去的观点中认为坏死不受信号通路调控，是被动的细胞死亡形式[14]。但随着研究不断深入，近年来发现细胞坏死也是一个由基因控制的高度有序的在一系列酶参与下完成的过程[15]。细胞坏死能够帮助机体维持正常的生理功能，在体内发挥着重要的作用[16]。然而，目前对于心肌细胞坏死的信号通路的研究还远远不够深入，因此针对心肌细胞坏死的分子机制进行研究,并以此开发新的生物标志物及治疗靶点具有重要意义。

A、B、C分别为A、B、C组，400倍图1 过表达实验各组细胞PI染色结果

D、E、F、G分别为D、E、F、G组，400倍图2 敲低实验各组PI染色结果

随着表观遗传学和生物信息学的兴起与发展，曾被认为是无用基因的非编码基因已成为研究的前沿领域，近年来非编码RNA也已经成为了心血管疾病研究的热点[17]。虽然piRNA在心脏组织中大量表达，但是其参与心脏相关各种疾病的发病机制仍不清楚[18]。piRNA可以通过与PIWI蛋白形成RNA-蛋白复合物参与基因调控[19]。在心肌细胞从多能细胞分化而来的过程中，可以观察到动态而特异的piRNA表达模式[20]。与正常的心脏相比，发生心肌细胞肥大的心脏组织中piRNA的表达水平异常，但其功能仍不清楚[21-22]。在生殖细胞中，piRNA与PIWI蛋白一起介导转座子和编码蛋白基因的调控[23]。而piRNA在调控心肌细胞坏死过程中的具体作用机制研究目前还比较匮乏，所以寻找心脏组织中特异表达的并且参与调控心肌细胞死亡的piRNA，并进一步阐明其作用机制，具有重要的研究意义。

本研究通过建立H9c2细胞的坏死模型，探讨piRNA在心肌细胞坏死中的机制及作用。本次实验中所使用的agomir-piR-10555、agomir-NC-piR-10555、antagomir-piR-10555以及antagomir-NC-piR-10555为相关siRNA，通过将其转染进细胞，以达到过表达或敲低piR-10555的目的。PI能够标记发生坏死的细胞核，被作为一种常见的坏死检测方式。细胞发生坏死时，胞质酶LDH释放到细胞外，通过检测细胞培养基上清液中LDH活性也可作为检测细胞坏死的一个指标。本实验结果显示，在H2O2处理24 h后，H9c2细胞中piR-10555的表达水平显著升高，因此后续实验均选择24 h作为细胞处理时间点。

本实验的结果显示，转染agomir-piR-10555后H9c2细胞内piR-10555的表达水平显著升高；通过PI染色发现，过表达piR-10555后PI阳性率相对于A、B组显著升高；LDH活性检测发现，在过表达piR-10555后细胞培养基上清液中LDH活性相对于A、B组显著升高。提示，过表达piR-10555后可以诱导心肌细胞发生坏死。转染antagomir-piR-10555后，H9c2细胞内piR-10555表达明显下降；通过PI染色发现，敲低piR-10555后，G组的PI阳性率相对于E、F组显著降低；LDH活性检测发现，敲低piR-10555以后，G组的细胞培养基上清液中LDH的活性相对于E、F组显著降低。提示，敲低piR-10555可以抑制H2O2诱导的心肌细胞的坏死。

综上所述，piR-10555能够参与调控由H2O2诱导的H9c2细胞的坏死。但piR-10555调控心肌细胞坏死的具体机制还有待深入研究。