基于环介导等温扩增技术的巴戟天检测方法的建立

王姝涵 隋爱华 韩亚斐 周泉 许行 姚如永

(青岛大学附属医院医学研究中心，山东 青岛 266003)

巴戟天(MorindaofficinalisHow)为茜草科巴戟天属药用植物，主产于广东、广西等地[1]。其干燥根作为四大南药之一，在传统中医药中具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效[2]。巴戟天的活性成分主要为环烯醚萜苷、蒽醌和糖类等[3-5]，具有抗不孕不育、抗抑郁和抗骨质疏松等作用[6-9]。常与巴戟天混淆的药材羊角藤、铁箍散、虎刺等在外部形态上与巴戟天极为相似，但药用价值和有效成分差异很大，选择不当将引起不良反应，影响临床用药安全[10]。根据药典标准，巴戟天的鉴定方式为显微鉴别、色谱分析等[11]，但这些鉴定方式存在灵敏度不够、耗时较长、设备昂贵等弊端[12-13]，因此临床迫切需要一种灵敏、快速、成本较低的巴戟天鉴定技术。环介导等温扩增(LAMP)技术是一种较为新颖的核酸扩增技术，由NOTOMI等[14]于2000年建立。在特异性引物、链置换型DNA聚合酶的作用下，靶基因于恒温条件15～60 min即可完成扩增反应[15]。加入荧光染料可通过明显的颜色变化客观判定检测结果[16]，通过实时浊度仪或实时荧光定量仪可对反应过程进行实时定量监测[17]。目前LAMP检测已广泛应用于临床诊断、病原体检测、病虫害排查等[18-20]，但尚未见巴戟天LAMP检测相关的研究报道[21]。DNA条形码是一种常用的分子鉴定工具，广泛应用于植物鉴定[22-23]。巴戟天二级内部转录空间(ITS2)序列是该物种最具特异性的标记序列之一，具有高度种间变异性和区分度[24-25]。本研究拟建立一种基于LAMP技术针对巴戟天ITS2序列的简便、快速、价廉检测方法，为巴戟天DNA分子鉴定提供新方式。

1 材料与方法

1.1 材料

选取巴戟天及与其外形或基因相似度较高的7种药材，分别为羊角藤(MorindaumbellataL.)、虎刺(Damnacanthusindicus)，铁箍散(Schisandrapropinquavar.Sinensis)、海滨木巴戟(Morinda

citrifoliaL.)、鸡眼藤(Morindaparvifolia)、白木通(Akebiatrifoliatasubsp.Australis)、南五味子(KadsuralongipedunculataFinetetGagnep)。巴戟天及其相似药材均来自青岛大学附属医院中药房，并经专业医师按药典标准进行鉴定，使用前均置于干燥环境下常温贮存。

1.2 DNA提取

将上述药材磨成粉末，并按照Sangon Biotechs Ezup柱式植物基因组DNA提取试剂盒的说明书要求的步骤分别提取总DNA，使用QuickDrop分光光度计检测所提取DNA的纯度和浓度。选出A260/A280比值高于1.80的DNA提取液，经TE缓冲溶液稀释使其终浓度为10 mg/L，置于-20 ℃保存备用。

1.3 生物信息学分析

在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank数据库中，通过Blast分析筛选出与巴戟天ITS2序列相似度>90%的基因序列，然后使用MEGA 7软件进行1 000次最大似然树比对，确定巴戟天LAMP检测的最适ITS2靶标序列，用于后续引物设计。

1.4 引物设计

根据生物信息学分析结果，利用在线引物设计软件Primer Explorer 5.0 (http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计LAMP引物，将符合标准的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物设计的标准为：GC含量范围为40%～60%，预测的熔化温度(Tm)范围为0～65 ℃，ΔG≤4 kcal/mol。引物序列见表1。

表1 巴戟天LAMP检测引物

1.5 最适反应温度的确定

按照Loopamp®DNA荧光目视等温扩增试剂盒的说明书冰上制备25 μL反应混合体系，其中的DNA提取液浓度为10 mg/L。于该体系中加入1 μL钙黄绿素作为目视检测的反应体系，混匀后使用水浴锅在58 ℃、60 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃的反应温度下分别进行LAMP扩增反应。扩增60 min后，80 ℃灭活10 min。扩增成功的判断标准为原橘色反应液肉眼观察变为绿色。根据绿色的深浅判断最适反应温度，绿色越深，说明产物的量越多，反应温度越适宜。

同时以实时荧光定量方法检测扩增时的荧光强度，验证基因扩增结果。制备上述25 μL反应混合体系，体系中加入1 μL SYBR GREEN Ⅰ(北京索莱宝科技有限公司)作为实时定量检测的反应体系，混匀以后使用荧光定量PCR仪(LineGene 9600，杭州博日科技有限公司)在58 ℃、60 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃的不同循环段温度下分别进行LAMP扩增反应。条件设置为循环段：60个循环，每个循环1 min；熔解段：80 ℃循环10 min。扩增成功的判断标准为反应时有扩增曲线生成。根据曲线到达的荧光强度判断最适反应温度，荧光强度数值越高，说明产物的量越多，反应温度越适宜。

1.6 特异性检测

将巴戟天与羊角藤、虎刺、铁箍散、海滨木巴戟、鸡眼藤、白木通、南五味子的DNA提取液及TE缓冲溶液(阴性对照)，按照1.5所述方法，并使用最适反应温度进行扩增，同时进行目视以及实时定量LAMP检测，评价该方法的特异性。

1.7 灵敏度检测

将浓度10 mg/L的巴戟天DNA提取液稀释至100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L后按照1.5所述方法，同时进行目视及实时荧光定量LAMP检测，确定LAMP的灵敏度。

将稀释为100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L的巴戟天DNA提取液按照TaKaRa Ex Taq®DNA聚合酶的说明书进行常规聚合酶链式反应(PCR)扩增，扩增引物使用表1中F3和B3各40 pmol，终体积为25 μL。用20 g/L琼脂糖凝胶电泳成像法检测水浴LAMP方法扩增结果和常规PCR方法扩增结果，比较两种方法的灵敏度。扩增成功的判断标准为凝胶上有条带产生，其中LAMP方法扩增的条带为梯形特征条带，PCR方法扩增的条带为200～300 bp间显示的常规条带。

2 结 果

2.1 物种比对结果

最大似然树比对结果显示，巴戟天AB715224序列独立聚为一支，与其他物种进化距离较远，物种分离清晰，说明这一序列具有良好的物种鉴别能力。见图1。图中物种名称后面括号内为所对应的基因序列号，连线处的数字为置信度。

图1 巴戟天及近缘植物基于ITS2序列的最大似然树

2.2 巴戟天LAMP检测的最适反应温度筛选结果

目视检测结果显示，反应温度为58 ℃时反应液颜色显示为橘色，没有扩增成功。其余反应温度时反应液均为绿色且颜色相近，说明扩增成功但无法判断出最适反应温度。见图2A。实时荧光定量分析结果显示，反应温度为63 ℃时曲线显示扩增最明显，扩增的荧光强度最高。由此确定巴戟天LAMP检测在58～68 ℃范围内的最适反应温度为63 ℃。见图2B。

A：目视检测结果，B：实时荧光定量检测结果图2 巴戟天LAMP检测最适反应温度筛选

2.3 巴戟天LAMP检测的特异性结果

巴戟天与其他7个物种的LAMP目视检测结果显示，阴性对照与其他物种的反应液均为橘色，显示没有扩增。含有巴戟天DNA的反应液由橘色变为绿色，说明扩增成功。见图3A。实时荧光定量分析结果显示，阴性对照与其他物种无扩增曲线生成，显示没有扩增。含有巴戟天DNA的反应液生成了扩增曲线，说明扩增成功。见图3B。

A：各物种的目视检测结果，B：各物种的实时荧光定量检测结果。其中1～9分别为阴性对照、巴戟天、羊角藤、虎刺、铁箍散、海滨木巴戟、鸡眼藤、白木通、南五味子图3 各物种LAMP检测结果

2.4 巴戟天LAMP检测的灵敏度

目视检测结果显示，巴戟天DNA提取液的浓度为0.01 μg/L时反应液颜色显示为橘色，没有扩增成功。其余浓度的反应液均由橘色变为绿色，说明扩增成功。见图4A。实时荧光定量分析结果显示，巴戟天DNA提取液的浓度为0.01 μg/L时无扩增曲线生成，显示没有扩增。其余浓度均生成了扩增曲线，说明扩增成功。见图4B。由此确定巴戟天LAMP检测的最低检测限约为0.10 μg/L

A：目视检测结果，B：实时定量检测结果图4 不同浓度巴戟天DNA提取液的LAMP检测结果

凝胶电泳成像检测结果显示，常规PCR方法扩增巴戟天DNA提取液的浓度为0.10 μg/L，无条带产生，没有扩增成功；其余浓度在200～300 bp间产生条带，说明扩增成功。见图5A。LAMP方法扩增巴戟天DNA提取液的浓度为0.01 μg/L时，无条带产生，没有扩增成功；其余浓度均生成了梯形条带，说明扩增成功。见图5B。因此可以确定巴戟天常规PCR检测的最低检测限约为1.00 μg/L。

A：常规PCR方法扩增检测结果；B：LAMP方法扩增凝胶电泳成像检测结果。其中1～5分别为100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L，M为DNA marker图5 不同浓度巴戟天DNA提取液的凝胶电泳成像检测结果

3 讨 论

包含中药及其提取成分的医药产品在疾病的预防和治疗中的使用越来越广泛，误用、混用和假冒中药将严重影响临床用药安全[26]。本研究从基因角度基于LAMP技术建立简便快捷、特异性强、灵敏度高的巴戟天检测方法，为巴戟天分子鉴定提供新的检测思路，解决了巴戟天及其表型与其相同、化学成分较相似的近缘物种鉴定困难的问题。

本研究基于巴戟天ITS2序列设计引物，该序列具有序列分歧度最小、遗传变异系数最大、序列较为保守的特征[27]。最大似然树比对结果显示，ITS2序列在巴戟天的系统研究和种属鉴定方面具有很大潜力，可能是最适合巴戟天种属的鉴定序列。

根据实验结果，巴戟天LAMP检测的最适反应温度为63 ℃，而且仅需水浴60 min左右即可完成对巴戟天DNA的扩增，反应完成后生成大量核酸并产生明显的颜色变化，检测结果清晰客观。因此巴戟天LAMP检测可简单有效地依据试管内反应液颜色变化进行目视定性检测，克服琼脂糖凝胶电泳检测结果易被污染且检测步骤繁琐的缺点。

巴戟天及其近缘物种LAMP检测的特异性实验结果证明，巴戟天可在本研究选择的样本范围内成功检测出巴戟天，具有较好的特异性。因此，该方法的应用性良好，可为茜草科植物的中药检测方法研究提供一定的参考价值。

根据灵敏度检测结果，该方法的最低检测限约为0.10 μg/L，约为常规PCR方法最低检测限的十分之一，显示了较高的灵敏度。这一结果提示，巴戟天LAMP检测方法有不低于同类型分子检测方法的灵敏度。

本研究的不足之处在于，植物尤其是含水、含糖量较多的植物，其DNA提取过程有时比较困难，而在分子检测领域的分析过程中，DNA提取失败等问题会影响检测灵敏度[28-29]。保证DNA提取质量，进一步探索高质量、高效率提取植物DNA的技术方法，是需要着力解决的方向之一。

综上，巴戟天LAMP检测具有良好的特异性、灵敏度和应用性，同时适配于PCR相关设备，根据凝胶成像和实时荧光定量扩增曲线得到半定量和定量的结果。因此该方法可利用现有各类设施，适合各级各类药品检测机构，应用前景广阔[30]，下一步可结合侧向流试纸条开发巴戟天即时检测(POCT)试剂盒以推广使用[31]。