参附注射液对烧伤合并海水浸泡大鼠血清及肺组织炎症因子及氧化应激的影响

乔媛媛, 熊 鸣, 马 伟, 李丹丹, 刘东东

(中国人民解放军海军总医院第六医学中心， 北京市 100037)

随着海洋活动半径的增大，海上事故及海上冲突时有发生，烧伤合并海水浸泡伤的发生率较高〔1〕，伤员坠海后，高渗、高盐海水造成伤员的二次打击。有研究表明外伤合并海水浸泡后，会引起伤员高渗性脱水、电解质紊乱、酸碱失衡、微循环障碍以及感染，造成多脏器功能衰竭，甚至死亡〔2〕。 参附注射液扶正补虚，是天然的急救药物，临床上常用于失血性、感染性休克等，作用机制涉及抗炎、抗氧化、抗凋亡、改善代谢等多个方面〔3〕。本实验以烧伤合并海水浸泡大鼠为模型，通过观察参附注射液改善模型大鼠血清和肺组织TNF-α、IL-1、IL-1β和MDA、SOD指标的水平以及肺组织病理改变，探讨参附注射液对此伤情可能的作用机理，为该类伤情救治的中医药治疗提供基础医学数据，具有一定的战备意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器设备选择体重为 150-200 g，雄性 SD大鼠。动物由中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK-(军)2014-0001，实验方案经过解放军总医院第六医学中心动物伦理委员会批准。 参附注射液购自雅安三九药业有限公司(国药准字Z20043117，5×10 ml ，雅安三九药业有限公司出品)，每ml药液中含生药红参100mg、附子100 mg。 自制垂直式圆柱状鼠笼(高20 cm，直径6 cm)、高速离心机(Thermo)、酶标仪(Thermo)、IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD和MDA 的ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)、甲醛、二甲苯、 乙醇、PBS和苏木精等均由北京市化学试剂有限公司提供。显微镜为日本奥林巴斯公司产品，酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 人工海水的配制根据文献报道的海水配方，配制成30‰的人工海水，参数指标为：渗透压(1250±11.25) mmol/L，PH 8.23，比重1.06，钠离子浓度(630±5.33) mmol/L，钾离子(10.88±0.68)mmol/L，氯离子 (658.8±5.52) mmol/L，室温(26±1)℃。

1.3 实验方法

1.3.1动物分组与实验 56只SD大鼠随机分组为正常组(NC)、烧伤合并海水浸泡组(SC)、和参附注射液组(SF6/12)及生理盐水注射组(YW6/12)的等实验组。实验前大鼠禁食12 h，背部30%区域脱毛后，按文献方法〔4〕电烙铁烧5 s钟，致背部30% TBSA深Ⅱ度烫伤。各组大鼠致伤后置于自制的圆柱状鼠笼内，直立浸泡于海水中(人工海水，水温25～27℃)，浸泡平面超过伤口创面。 SF实验组和YW组实验安排为：分别在实验前3天每天连续腹腔注射参附注射液或者生理盐水，剂量为15ml/kg。烧伤致伤后， SF和YW组的大鼠分别再次注射参附注射液或生理盐水(剂量和浓度同上)，再将大鼠放置在自制笼具中于海水中浸泡6小时或者12小时，分别采集样本。

1.3.2血液及组织收集及测定 腹主动脉采血于抗凝采血管，1 h后4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清液于-80 ℃保存备用。按照试剂盒说明，检测大鼠血清中的炎症因子和氧化应激指标。 称取0.1 g肺脏组织，经预冷的PBS漂洗，拭干，加入0.9 ml生理盐水，制备成10%的组织匀浆，低温3000 转/min离心15 min，取上清冷冻备用。按照试剂盒说明，检测大鼠组织匀浆中的炎症因子和氧化应激指标。

1.3.3病理组织学检测 采集各组肺组织，用PBS清洗后，10%中性多聚甲醛溶液固定，进行常规酒精梯度脱水、石蜡包埋切片，制备病理切片(厚度5 μm)，经苏木精-伊红染色，显微镜下观察肺脏病理改变情况。

2 结果

2.1 大鼠血清炎症因子的表达变化实验结果表明，烧伤合并海水浸泡组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均高于正常组(P<0.05)。生理盐水注射6h和12h组和参附注射液6h和12h组血清中此三个炎症指标水平均有下降，与正常组和烧伤合并海水浸泡组大鼠血清中的炎症因子差异具有统计学意义(P<0.05)。参附注射液6小时组的IL-6、IL-1β、TNF-α较生理盐水注射6小时组的指标均有降低，其中TNF-α的差异具有统计学意义(P<0.05)；参附注射液12小时组的IL-6、IL-1β、TNF-α较生理盐水12小时注射组的指标均有降低，其差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-a的比较

2.2 大鼠肺组织炎症指标各组大鼠肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较见表2，结果显示烧伤合并海水浸泡组大鼠的此三个炎症指标明显升高，与正常组有显著性差异(P<0.05)；参附注射液6 h组的IL-6、IL-1β、TNF-α与生理盐水注射液6 h组指标差异均有统计学意义(P<0.05)。参附注射液12 h组和生理盐水注射12 h组相比，IL-6、TNF-α差异具有统计学意义(P<0.05)，参附注射液12 h组大鼠的指标接近正常组数值。

表2 各组大鼠肺组织炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-a比较

2.3 大鼠血清中氧化应激指标与正常对照组大鼠血浆中MDA比较，烧伤合并海水浸泡组明显增加(P<0.05)，参附注射液6 h组大鼠血清中MDA降低，与正常组、烧伤合并海水浸泡组和生理盐水6 h组均有差异(P<0.05)；12 h后的MDA值为4.52±1.99 μmol/L，与烧伤合并海水浸泡组及生理盐水12 h组均有差异(P<0.05)。 烧伤合并海水浸泡组大鼠血清中T-SOD较正常组大鼠显著降低(P<0.05)，参附注射液6 h和12 h的处理后，T-SOD明显上升，12 h后数值基本与正常组接近，与正常组没有差异(P>0.05)，参附注射液12 h组的T-SOD与生理盐水12 h组差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清氧化应激因子MDA、T-SOD比较

2.4 大鼠肺组织氧化应激指标与正常组大鼠肺组织MDA比较，烧伤合并海水浸泡组大鼠肺组织MDA明显增加(P<0.05)，参附注射液处理后6、12 h后MDA降低，12小时后的MDA值接近正常组，与其差异无统计学意义(P>0.05)；6 h和12 h检测点，参附注射液组MDA含量较注射盐水组MDA均显著降低(P<0.05)。 与正常组相比，烧伤合并海水浸泡组大鼠肺组织T-SOD的活力显著降低(P<0.05)。经过6 h和12 h，T-SOD活性增加，均与单纯烧伤组有差异(P<0.05)；参附注射液6 h组大鼠肺脏SOD较生理盐水注射组增加，组间差异有统计学意义(P<0.05)。参附注射液12 h组大鼠肺脏SOD和继续好转，与生理盐水12 h组指标的组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠肺组织氧化应激因子MDA、T-SOD比较

2.5 肺脏组织学情况肺组织肉眼观察见正常组的肺组织颜色淡粉红色，表面光滑，质地较软，无明显出血及坏死，显微镜下观察到肺组织结构完整，肺泡间隔较薄，肺泡腔内未见炎症细胞浸润，管腔内可见少量蛋白黏液及红细胞。图1显示，单纯烧伤组的肺组织结构中度异常，部分动脉中膜明显增厚，管腔狭窄，如黑色箭头所示，外膜水肿间隙增大，并可见大量嗜中性粒细胞浸润。生理盐水注射12小时组大鼠的肺组织整体结构中度异常，肺泡间隙明显增宽，轻微实质化，肺间质可见明显充血；参附注射液12组大鼠的肺组织结构轻度异常，部分肺泡腔中巨噬细胞数量增多，如黑色箭头所示，肺泡壁无明显增厚。

图1 肺组织的比较 A:空白对照；B：烧伤合并海水浸泡组； C：生理盐水12小时后；D：参附注射液注射12小时后

3 讨论

我国有丰富的中药资源，中草药的作用在多种疾病治疗中凸显其重要性〔5,6〕。参附注射液是重要的中药制剂，组方源自参附汤，有效成分是人参皂苷、 乌头生物碱类，主治元气大亏，具有“多靶效应”而应用于心血管疾病及多种急症危重病的治疗，其疗效显著。有报道表明参附注射液对肺损伤及肾功能衰竭、心衰等具有保护作用〔7-9〕，但作用机制尚不明确，仍待进一步研究。本研究应用参附注射液对烧伤合并海水浸泡大鼠进行探索性干预治疗，观察其对大鼠烧伤合并海水浸泡伤肺损伤的保护作用及其可能的机制。

我们的前期工作也证明〔10〕，严重烧伤合并海水浸泡导致消化道血供急剧减少，组织毛细血管微循环障碍，缺血缺氧引起酸中毒，自由基和炎性介质等水平升高，与凋亡相关的基因表达增强，启动了内源性和外源性及其他细胞凋亡激活途径，诱导内皮细胞、淋巴细胞和肠黏膜上皮细胞凋亡，诱发脓毒症及 MODS；肠道紧密连接开放，肠道通透性增大，诱发胃肠屏障功能受损，中性粒细胞过度活化引起炎症反应，继发肺内炎性反应失控造成肺的损伤。 在炎症反应过程中，内源性炎症介质被激活，大量炎症因子如TNF-α，IL-6等释放，启动炎症反应递质连锁反应，激活机体中性粒细胞和巨噬细胞，并造成更多炎症因子的释放〔11〕；外周循环炎症细胞迁移至肺间质及肺泡，造成肺部的炎症〔12,13〕，与此同时炎性因子与炎症细胞间相互促进，加重感染症状。

TNF-α表达水平可反映机体损伤程度，被认为是炎症发生发展的指标〔14〕。IL-6为迟发性细胞因子，有证据显示，血清IL-6水平可作为细胞因子级联反应激活的标志物，反映宿主炎症反应与疾病严重程度间的关系，它也是引起肺损伤急性炎症反应期的主要炎症细胞因子。 IL-1β是白细胞介素家族常见的炎症因子，由单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞等组成〔15〕。IL-1β作为一种炎症前调节因子，可以反映早期损伤的严重程度，并通过自分泌激活核因子NF-κB，增加IL-6和TNF-α的表达〔16〕。本实验观察到烧伤合并海水浸泡伤模型大鼠血清和肺组织的炎症因子水平升高，应用参附注射液干预组的大鼠血清炎症水平较对照组明显降低，肺脏病理显示炎症有所改善，提示参附注射液能够通过抑制炎症因子的表达，从而减轻肺脏炎症损伤。

氧化应激近年来也倍受关注，急性疾病过程中的氧化损伤是导致细胞损伤、器官功能失调的重要原因，氧化应激反应参与肺损伤的发生、发展。T-SOD是生物体内重要的抗氧化酶，可催化机体内超氧离子发生歧化反应，清除氧自由基，保护细胞免受损伤〔17〕。MDA为膜脂过氧化的产物，其含量高低可反映体内脂质过氧化水平和氧自由基对细胞膜结构的损伤程度〔18〕。因此T-SOD越低，MDA越高表明机体过氧化应激反应越严重。 蒲江涛等〔19〕报道参附注射液对肺损伤的保护作用，发现参附注射液可以显著降低供肺缺血-再灌注损伤后MDA的含量，提高SOD的活力，对肺水肿有较好的治疗作用。本实验表明烧伤合并海水浸泡组大鼠血清和肺组织的SOD水平明显降低，MDA含量升高，提示炎症发生后，SOD被大量消耗，氧化调节失衡，机体各组织在自由基的攻击下受损。参附注射液组大鼠的氧化应激指标有所改善，炎症因子降低，SOD升高而MDA含量下降，证实参附注射液能够有效减轻炎性反应程度，缓解氧化应激反应，缓解肺部的病理损伤。

本研究初步探索参附注射液对烧伤合并海水浸泡伤的中医药治疗，为中医方剂治疗急危重症提供基础实验依据。综上所述，参附注射液能稳定细胞膜，减少炎症因子和氧化应激的释放，降低IL-6、IL-1β、TNF-α含量，干预调节炎症反应；提高T-SOD，降低MDA水平，降低细胞氧耗，抑制氧化应激水平，减轻脂质过氧化损伤，加速自由基的排出，平衡机体氧化与抗氧化作用，从而保护肺脏组织。