莲藕提取物体外抗氧化作用研究

麻玉莹， 边祥雨， 于艺婧， 杨忍忍， 高蔚娜， 郭长江

(军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津，300050)

莲藕是植物莲的根茎，是亚洲地区常见的食药两用植物。近年来，人们对莲藕的功能成分进行了广泛的研究，为阐明莲藕的医药特性以及验证其作为功能性食品的有效性提供了可靠的证据。据报道，莲藕具有多种药理作用，如降血糖、护肾、抗炎、止血作用，此外还具有保肝护肝、精神药理和免疫调节作用〔1〕。 探索天然抗氧化剂以抵抗氧化应激已成为近年来的研究热点〔2〕。目前关于莲藕的抗氧化功能多集中于藕节部位，关于莲藕可食部提取物的抗氧化功能报道较少。体外抗氧化作用包括自由基清除率、抑制脂质过氧化等，常采用化学法或建立细胞模型进行评价。本研究以莲藕可食部提取物为研究材料，测定莲藕提取物的总抗氧化力及DPPH、羟自由基清除率；选用C2C12细胞，以H2O2诱导产生氧化损伤，检测细胞活力以及SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量来评价莲藕提取物的抗氧化作用，为莲藕产业的深加工奠定基础，为今后抗氧化产品的研发开辟新径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器莲藕(天津市王顶堤菜市场)；小鼠成肌(C2C12)细胞(美国ATCC细胞库)；胎牛血清、CCK-8(美国Invigentech公司)；芦丁标准品(上海源叶生物科技有限公司)；抗坏血酸(阿拉丁试剂有限公司)；MDA、GSH-Px、CAT、SOD测试盒(南京建成生物工程研究院)；DPPH、羟自由基清除能力、总抗氧化能力检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。 细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司)；超级酶标仪(美国 Bio Tek 公司)；旋涡混合器(无锡杰瑞安仪器设备有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1莲藕提取物的制备 将购买的新鲜莲藕洗净、晾干后去皮，将日常食用部分切成小块，采用榨汁机榨汁后，对新鲜莲藕汁进行真空冷冻干燥，干燥后得到莲藕粉末状样品。按照文献〔3〕方法进行提取。

1.2.2细胞培养 细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，在37 ℃、5% CO2的条件下培养，当细胞融合至80%以上后，进行传代。

1.2.3莲藕提取物清除DPPH、羟自由基作用及总抗氧化能力的检测 按照试剂盒说明书，测定莲藕提取物对DPPH、羟自由基清除作用及总抗氧化能力。设置芦丁与抗坏血酸(VC)为阳性对照。

1.2.4莲藕提取物对H2O2诱导C2C12细胞氧化损伤的保护作用 建立氧化损伤模型：选择对数生长期的C2C12细胞，接种于96孔板中，稀释细胞个数为5×104个/孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后，弃去旧培养基，然后进行分组：空白对照组与梯度浓度的H2O2处理组(0、100、200、400、600、800、1000 μmol/L)，空白对照组加入DMEM进行培养，H2O2处理组加入各浓度的H2O2进行培养，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1h，通过酶标仪于450 nm波长下测定OD值，根据CCK-8试剂盒说明书计算细胞存活率〔4〕，确定H2O2适宜浓度。 CCK-8法检测莲藕提取物对细胞的保护作用：选择对数生长期的C2C12细胞，接种于96孔板中，稀释细胞个数为5×104个/孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后，弃去旧培养基，然后进行分组：空白对照组、H2O2模型组、不同浓度的莲藕提取物保护组(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL)。按照上述分组，首先不同浓度的莲藕提取物要预先处理12 h，然后加入200 μg/mL H2O2溶液(根据上文结果测得)处理6 h，空白对照组加入DMEM进行培养，H2O2模型组加入200 μg/mL H2O2溶液进行培养，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h，用酶标仪测出各孔OD值，根据CCK-8试剂盒说明书计算细胞存活率，确定莲藕提取物适宜浓度。

1.2.5莲藕提取物对H2O2诱导C2C12细胞SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的影响 细胞SOD、CAT、GSH-Px活性与MDA含量测定：选择对数生长期的C2C12细胞，稀释细胞个数为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔接种2 mL。培养24 h后进行分组：正常对照组、H2O2模型组、莲藕提取物组。细胞经过不同样品和H2O2处理后，收集培养液进行各指标的测定。分别用试剂盒提供的方法测定细胞内SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA含量。

2 结果

2.1 莲藕提取物清除DPPH自由基、羟自由基能力与总抗氧化力如图1所示，当浓度为5mg/ml时，莲藕提取物具有较好的清除DPPH、羟自由基的能力与总抗氧化力。

图1 DPPH自由基、羟自由基清除能力与总抗氧化力LRE：莲藕提取物；Rutin：芦丁；VC：抗坏血酸a：DPPH自由基清除率；b：羟自由基清除率；c：总抗氧化力*P<0.05,**P<0.01

2.2 莲藕提取物对H2O2作用下C2C12细胞存活率的影响如图2所示，H2O2对细胞的氧化损伤随浓度的增大而增强，一般应选择细胞存活率在50%～70%范围内，便于试验观察研究〔5〕。因此，选择200μmol/L H2O2进行后续细胞损伤保护试验。

图2 不同浓度H2O2对C2C12细胞存活率的影响

如图3所示，在C2C12细胞中，不同浓度的莲藕提取物预处理24h，对H2O2诱导的细胞损伤有明显的保护作用，且当莲藕提取物浓度为40 mg/mL时，对C2C12细胞的保护作用基本达到上限(P<0.01)，当莲藕提取物浓度为100 mg/mL时，保护作用反而下降。上述结果表明，一定浓度的莲藕提取物能够减轻H2O2暴露造成的细胞氧化损伤。

图3 莲藕提取物对H2O2作用下C2C12细胞存活率的影响*P<0.05,**P<0.01

2.3 莲藕提取物对H2O2诱导的C2C12细胞MDA产生的抑制作用我们选择保护作用最为显著的莲藕提取物浓度为40 mg/mL对细胞进行处理，实验结果表明(如图4所示)，与对照组细胞相比，H2O2模型组细胞MDA含量明显增加(P<0.01)；与H2O2模型组细胞相比，莲藕提取物处理组可以明显减少H2O2暴露导致的C2C12细胞的MDA产生(P<0.01)。

2.4 莲藕提取物对H2O2诱导的C2C12细胞抗氧化酶系(SOD、CAT、GSH-Px)活性的影响SOD、CAT和GSH-Px 是机体内主要的抗氧化酶。我们选择保护作用最为显著的莲藕提取物浓度为40mg/mL对细胞进行处理，结果表明(如图5所示)，与对照组相比，H2O2暴露可以显著降低C2C12细胞SOD、GSH-Px与CAT活性(P<0.05)；莲藕提取物处理后可以显著增加SOD、GSH-Px与CAT活性，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。以上结果提示莲藕提取物可以通过保护抗氧化酶活性来减轻H2O2所致的氧化应激损伤。

图 4 莲藕提取物对H2O2引起的C2C12细胞脂质过氧化产物 MDA的影响figure_titleControl：空白对照组；Model：H2O2模型组；LRE：莲藕提取物组**P<0.01

图5 莲藕提取物对H2O2引起的C2C12细胞抗氧化酶活性的影响Control：空白对照组；Model：H2O2模型组；LRE：莲藕提取物组**P<0.01

以上结果表明，莲藕提取物能抑制H2O2诱导的C2C12细胞氧化损伤，对H2O2诱导的C2C12细胞具有一定的保护作用，能够提高细胞SOD、CAT和GSH-Px活性，降低MDA含量，表明莲藕提取物对C2C12细胞有明显的抗氧化作用。

3 讨论

氧化应激是指自由基产生与抗氧化防御之间的不平衡，与许多慢性退行性疾病有关。目前，水果、蔬菜及其抗氧化剂提高人体内抗氧化水平的研究已引起广泛关注，其抗氧化活性的产生可归因于多种机制。MDA是脂质过氧化的酶生物标志物和终产物，细胞膜释放的MDA能与蛋白质和核酸发生反应，引起交联聚合，使蛋白质无法正常合成，MDA还能引起细胞膜结构和功能的异常，从而导致机体生理状态的异常，故MDA可以间接显示机体清除氧化产物能力和抗氧化活性〔6〕。SOD、CAT和GSH-Px 是机体内主要的抗氧化酶，所有的细胞都具有天然的抗氧化防御系统来中和活性氧的影响，其中，SOD、GSH-Px和CAT起核心作用，SOD将超氧阴离子转化为H2O2和O2，H2O2的毒性比超氧物小得多，SOD能够有效清除超氧阴离子自由基，通过抗氧化应激来缓解疲劳，是最重要的自由基清除剂之一，其活性是自由基清除的间接指标，对维持体内ROS的动态平衡至关重要〔7-8〕；GSH-Px使用GSH作为氢供体将H2O2还原为H2O和O2，GSH-Px是细胞内对抗活性氧的主要酶抗氧化防御物质，在减轻细胞氧化损伤中起着重要作用；CAT将H2O2分解为H2O和O2，以保护机体细胞稳定的内环境和细胞的正常功能〔9-11〕。因此，本研究选用C2C12细胞，以H2O2诱导产生氧化损伤，通过检测细胞活力以及SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量，来评价莲藕提取物的体外抗氧化作用。

本研究结果显示，H2O2暴露导致C2C12细胞存活率降低，各剂量莲藕提取物预处理之后，各组细胞活力明显高于H2O2模型组，表明莲藕提取物H2O2诱导C2C12细胞具有较好的保护作用，减轻了H2O2引起的细胞损伤程度；H2O2暴露后细胞抗氧化酶SOD 、CAT和GSH-Px 活性显著降低及细胞脂质过氧化产物MDA 明显增加，加入莲藕提取物进行预保护后，细胞SOD活性增强，SOD是机体抵抗自由基的主要酶防御系统，SOD活性的增加表明机体正在进行抗氧化，以防止自由基诱导的损伤，减少细胞损伤；同时，CAT和GSH-Px活性显著增强、MDA含量减少，显示莲藕提取物对于C2C12细胞氧化损伤具有较好的保护作用，能通过降低脂质过氧化产物的产生、提高抗氧化酶活性来抑制H2O2诱导的细胞氧化损伤。以上研究结果将有助于莲藕作为食源性抗氧化剂的开发应用，并为氧化应激相关疾病的预防与治疗提供理论依据。