大鼠多重细菌感染肺炎模型的建立

2021-07-22 05:43董辉伟陈郑珊王丽芳李君文
解放军预防医学杂志 2021年1期
关键词:抗性肺泡肺部

董辉伟, 陈郑珊, 王丽芳, 金 敏, 李君文, 杨 栋

(军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所, 天津 300050)

肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症,它可由多种微生物引起,包括细菌、病毒和真菌等,是全世界发病率和死亡率最高的疾病之一〔1-2〕。在住院过程中,尤其是在重症监护室(Intensive care unit,ICU),50%的危重症患者发生院内感染,其中,呼吸系统感染占60%以上,使得患者的死亡风险成倍增加〔3〕。研究表明,来自受污染的示波器、旁路机、自来水和透析液等相关医疗设施或试剂的革兰氏阴性菌传播频率越来越高〔4〕,各种导管的使用使患者易受革兰氏阴性杆菌、金黄色葡萄球菌和放线菌等病原体侵害,气管插管更是极易使患者患呼吸机相关性肺炎。 病原体通常通过患者吸入口咽部分泌物进入下呼吸道,是否发展为肺炎在很大程度上取决于患者的吸液量、吸入频率以及吸入病原菌的接种量相对于宿主免疫的毒力。为探索细菌性感染肺炎的机制,首先要建立相关细菌的肺炎动物模型。目前,各文献报道的动物肺炎模型多是单一菌种感染,而临床常见的肺炎感染,尤其是医院获得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia,HAP),往往都是多重细菌感染〔5〕。根据中国耐药基因监测网报告,2019年全国临床分离菌株排前两位的分别为大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn),并且肺炎克雷伯菌同样是呼吸系统分离菌株最常见的细菌〔6〕。本文通过气管滴注大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌建立大鼠肺炎模型,更充分地模拟多重细菌感染性肺炎。

1 材料与方法

1.1 菌种大肠埃希菌MG1655(E.coli),具有四环素抗性(本实验室保存);肺炎克雷伯菌ATCC35657(Kpn),具有美罗培南抗性(本实验室改造)。接种前过夜培养,离心后使用灭菌PBS重悬,使用多功能酶标仪通过OD600 nm值测定,调节浓度至109 CFU/mL。

1.2 实验动物及分组21只雄性SPF级SD大鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司),体质量180-200 g,随机分为7组,每组3只,观察不同时间大鼠肺部感染情况。大鼠自由饮无菌水和进食灭菌食物,屏障设备内饲养条件严格控制 (温度:20~25℃;湿度:50%~70%;光照/黑暗:12 h/12 h),实验过程对动物的处理符合军事医学研究院动物伦理审查标准。

1.3 动物实验与样本采集大鼠经乙醚吸入麻醉后,将其竖立固定在操作台,使用镊子拉出大鼠舌头, 用移液器从大鼠气管注入300 μL等体积E.coli与Kpn混合菌液。接种后使大鼠保持直立位约30 s,以保证接种菌液被充分吸入肺部〔7〕。 在不同时间点(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、8 h、72 h),使用戊巴比妥钠过量麻醉大鼠杀鼠取材,其中0 h组为对照组,灌菌后立即取材。通过心脏采血,加入EDTA抗凝管做血常规分析,而后将大鼠右上肺通过无菌缝合线结扎,只灌洗大鼠肺部其余部分,使用10 mL注射器共吸取20mL(第1次8 mL、第2次6 mL,第3次6 mL)灭菌PBS溶液对肺内部进行反复灌洗,取得支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)样品并立即置于冰上,留取5 mL用于抗性筛查培养,其余全部冻存于-80 ℃冰箱。将结扎的右上肺切除,放入4%多聚甲醛固定以进行苏木精和伊红(H&E)染色及病理分析。

1.4 平皿倾注法细菌计数分别将灌洗液取出1 mL加入9 mL灭菌PBS中稀释10倍,依此方法将灌洗液稀释成4个浓度梯度。将不同浓度梯度灌洗液分别取出1mL使用倾注法进行抗生素抗性筛选。E.coli具有四环素抗性,但不具有美罗培南抗性,Kpn具有美罗培南抗性,但不具有四环素抗性。因此,含有四环素终浓度为60 mg/mL的平皿将筛选出E.coli,含有美罗培南终浓度为3 mg/mL的平皿将筛选出Kpn。

1.5BALF炎症因子检测使用ELISA试剂盒(四正柏生物科技有限公司)通过酶标仪检测BALF中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素1-α(Interleukin-1α,IL-1α)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)水平变化。

1.6 统计分析使用OriginPro 8.5对菌落计数结果进行趋势拟合分析。使用GraphPad Prism 7对不同时间段血细胞计数及BALF炎症因子进行One way ANOVA统计检验,P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 平皿倾注法BALF菌落计数经平皿抗性筛查培养,发现E.coli数量(图1A)、Kpn数量(图1B)及两者总数量(图1C)在大鼠肺部呈指数下降,尤其在前6个小时减少速度最快,在72小时,大鼠肺部大部分加入细菌已被清除。

图1 BALF菌落培养计数注:A.E.coli数量 B.Kpn数量 C.E.coli与Kpn总数量

2.2 血液中免疫细胞检测与对照组比较,各组血液中白细胞(WBC)、中性粒细胞(Neu)、淋巴细胞(Lym)水平均略有升高,在48 h相对较高,而后在72 h出现下降(图2A、图2B、图2C),但无统计学差异。

图2 大鼠血细胞计数注:A.白细胞数量 B.中性粒细胞数量 C.淋巴细胞数量

2.3BALF炎症因子变化通过对大鼠BALF中炎症因子TNF-α、IL-1α、IL-6水平检测发现,与对照组相比,BALF中上述炎症因子均呈现先升高后下降的趋势。其中,TNF-α、IL-6在3 h、6 h和对照组有显著差异,且在6 h左右达到峰值;IL-1α在6 h、12 h和对照组有显著差异,也在6 h左右达到峰值。见图3。

图3 BALF炎症因子变化注:A.TNF-α浓度 B.IL-1α浓度 C.IL-6浓度

2.4 肺组织病理分析对不同时间组肺组织固定并进行H&E染色发现,与对照组正常肺组织结构相比,3 h肺泡间质轻微增厚,但未见明显炎症细胞浸润;6h部分肺泡萎缩塌陷,肺组织轻度实质化并可见明显炎症细胞浸润;随时间延长,肺组织病理损伤进一步加重,在48 h,肺组织整体结构异常,肺泡萎缩塌陷进一步加重,肺轻度实质化伴明显炎症细胞浸润(图4);72 h肺损伤与48 h基本一致。

图4 大鼠肺组织病理注:A.0 h B.3 h C.6 h D.48 h

3 讨论

医院获得性肺炎是肺炎最常见的类型,在欧洲每年发生多达50万例〔8〕。在我国,根据Xiong等报道,在696例医院感染患者标本中共检出病原菌1872株,其中下呼吸道感染占比约40%,感染的细菌中又以Kpn为主,占比约20%〔9〕。根据Che等报道,临床108例多重耐药菌感染的患者中,共检出病原菌130株,其中呼吸系统感染占比75%,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌为主〔10〕。 HAP往往导致严重的医疗后果,包括住院时间延长,长期体质虚弱和抑郁以及死亡率增加〔11〕。HAP也给患者带来沉重的经济负担,在欧洲,每次治疗的平均费用为4万欧元,在美国,每年的医疗费用达到80亿美元〔12〕。当前,预防和治疗HAP主要是通过使用抗生素减少呼吸系统细菌载量〔5〕。但HAP往往感染不止一种细菌,尤其随着各种耐药细菌病原体的出现,HAP的治疗将变得更加困难,其中在重症患者中,临床治愈率通常不超过70%〔13〕。在未来十年内,预防和治疗HAP的效率将变得更低〔14〕。 建立有效的动物感染模型是研究细菌性肺炎的基础。本实验中大鼠气管滴注加入的细菌含有特定抗生素抗性,用含特定抗生素的培养基能够较好地区分出加入细菌在大鼠肺部的数量变化,并排除支气管土著菌或环境中其他细菌的干扰。本研究发现,E.coli和Kpn在大鼠气管滴注后均快速被杀灭或清除,尤其在前6小时减少最快,充分地反映了呼吸系统对外来病原体强大的防御能力。 目前对于不同品系大鼠的血细胞数量并没有统一的参考标准,与人血液中性粒细胞在白细胞中占比高不同,大鼠白细胞中,淋巴细胞占比更高,这与以往文献报道一致〔15-16〕。本实验中,大鼠肺部染菌后,血细胞中白细胞总数、中性粒细胞及淋巴细胞计数与对照组相比虽然没有统计学差异,但均略有升高,且在48 h达到相对较高水平,在72 h出现下降。

在大鼠感染细菌后,淋巴细胞等免疫细胞活化并释放多种细胞因子。TNF-α是由单核巨噬细胞、树突状细胞等产生的具有广泛生物学活性的多肽调节因子,可被多种刺激物诱导发生,在炎症反应的启动中发挥关键作用。白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。其中,IL-1α能够促进趋化因子及其他细胞因子的分泌,诱导其下游的炎症介质合成及表达,激发炎症的级联反应,扩大炎症反应等〔17〕;IL-6可起到刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖,刺激细胞毒性T细胞活化,增强自然杀伤细胞的裂解功能等。我们发现,在BALF中炎症因子反映炎症变化较迅速,在肺部染菌后3 h即开始出现,6 h左右达到峰值。随接种时间延长,大鼠肺内外源细菌被逐渐清除,炎症因子水平也不断下降,基本能够反映肺部早期急性炎症感染变化。

经肺组织病理分析发现,在染菌后3 h即出现肺泡间质轻微增厚,但未见炎症细胞浸润,6 h可见明显炎症细胞并出现肺组织轻度实质化改变。之后虽然大鼠肺内加入的细菌数量已经大量减少,但是肺组织病理变化却进一步加重。肺泡萎缩塌陷、肺实质化进一步加重并伴明显炎症细胞浸润。反映了在大鼠肺部细菌被清除之后,其炎症反应带来的损伤并没有随之减弱,反而在短期内会进一步加重。

本实验通过气管滴注大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌混合菌液,探究了外源细菌在大鼠肺部的数量变化情况,对支气管与肺泡灌洗液中炎症因子水平与肺组织病理分析,结果表明大鼠肺部炎症明显,为后续研究多重细菌感染性肺炎奠定了基础。

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