KLF9和KDM1A在神经胶质瘤中的表达及意义

陈义 何堒 张伟 田晓金 李丹丹

神经胶质瘤约占所有原发性脑肿瘤的40%，起源于神经胶质细胞，美国每年约有13 000人死于该疾病[1,2]。探究神经胶质瘤的发病机制及其发生发展中的重要生物分子，对神经胶质瘤的诊断和治疗具有重要意义[3]。Krüppel样因子9(Krüppel-like factor 9，KLF9)是KLF家族成员，含锌指结构，与真核细胞转录调控密切相关。研究证明，KLF9在体外抑制胚胎和RGC中的神经突触出生长，且能够促进体内轴突再生[4]。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine-specific histone demethylase-1，KDM1A)能特异性的对单甲基化和二甲基化的H3K4脱甲基，在多种肿瘤中呈高表达，其高表达能促进肿瘤发生[5]。研究表明，KDM1A过表达可促进非小细胞肺癌癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。KLF9对神经元生长具有调节作用，KDM1A在多种肿瘤中发挥致癌作用，但二者在神经胶质瘤中的作用少见报道[7,8]。本研究将探讨KLF9和KDM1A在神经胶质瘤中的表达及意义，以期为神经胶质瘤的治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年6月至2017年1月本院进行手术切除63例神经胶质瘤患者，术中取癌组织作为试验组，取其癌旁组织(距肿瘤边缘>2 cm)作为对照组。其中男35例，女28例；年龄23～69岁，平均年龄(46.51±11.32)岁；肿瘤大小≤3 cm 30例，>3 cm 33例；Karnofsky(KPS)评分[9]>80分16例，≤80分47例。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)中枢系统肿瘤病理分型标准[10]分为：Ⅰ型21例，Ⅱ型17例，Ⅲ型10例，Ⅳ型15例。对神经胶质瘤患者进行为期3年随访，通过电话或邮件方式定期记录患者生存状况，随访开始时间为术后第1天，截至2020年2月1日，存活24例，死亡39例，无失访病例。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①病理确诊为神经胶质瘤者；②术前未进行放、化疗者；③临床资料完整者；④患者或家属同意参加研究，签署知情同意书。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②合并心、肝、肾等疾病者；③非正常死亡者；④术后复发，再次手术者。

1.3 主要仪器与试剂 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：Step One Plus )购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；光学显微镜(型号：DM1000)购自德国徕卡公司；TRIzol Reagent总RNA提取试剂(批号：15596026)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；通用RT-PCR试剂盒(M-mlV)(批号：RP1100)购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒(Prime Script RT reagent Kit)(批号：RR037A)购自日本TaKaRa公司；EDTA修复液(批号108-367)购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗人KLF9多克隆抗体(批号：NBP1-88507)购自美国Novus Biologicals公司；兔抗人KDM1A/LSD1多克隆抗体(批号：ALS12973)购自上海煊翎生物科技有限公司；免疫组化试剂盒(通用型，批号：AAPR389-A100)购自广州沛瑜生物制品有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 样品采集:取患者术中癌组织作为试验组，取其癌旁组织作为对照组。将所有样本分为两份：一份用于制作石蜡切片，另一份用于提取RNA，-80℃冰箱保存。

1.4.2 qRT-PCR法测定神经胶质瘤组织中KLF9和KDM1A mRNA的表达:-80℃取出样本，提取总RNA：向样本中加入1 ml TRIzol进行裂解，按照TRIzol RNA提取步骤进行操作，所得RNA溶于RNase Free H2O，检测其纯度及浓度，存于-80℃备用；按照Prime Script RT reagent Kit说明书进行反转录，所得cDNA置于-20℃保存。qRT-PCR反应(20 μl体系)：cDNA模板2 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，dH2O 7 μl，每个样品做3个平行。根据目的基因设计对应的引物，内参为GAPDH。反应条件：94℃ 30 s，95℃ 10 s、59℃ 10 s，40个循环，在qRT-PCR仪上反应。根据各样本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算 KLF9和KDM1A mRNA相对表达量。引物由日本TaKaRa公司合成。见表1。

表1 KLF9和KDM1A及内参基因GAPDH引物序列

1.4.3 免疫组化检测神经胶质瘤组织中KLF9和KDM1A蛋白表达情况:石蜡切片脱蜡水化。微波抗原热修复，室温冷却后，加3% H2O2孵育10 min，加EDTA修复液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗5 min×3次，滴加一抗工作液，4℃过夜。PBS冲洗5 min×3次，加入二抗37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次。DBA显色，显色成功后，蒸馏水冲洗，苏木素复染，乙醇脱水，透明处理，封片镜检。结果判定：细胞中存在棕色或棕黄色颗粒即为阳性细胞。随机选取5个视野(×400)，计数阳性细胞数率：1分为阳性细胞数≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～80%，4分为81%～100%；根据着色强度：1分为淡黄色，2分为中棕黄色，3分为棕褐色；总分=阳性细胞率×着色强度，总分1～3分记为阴性，4～12分记为阳性。

2 结果

2.1 qRT-PCR 法测定组织中KLF9和KDM1A mRNA的表达 试验组KLF9 mRNA的表达量明显低于对照组(P<0.05)，KDM1A mRNA表达明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组KLF9和KDM1A mRNA表达情况比较

2.2 2组KLF9和KDM1A蛋白表达情况 试验组KLF9蛋白的阳性表达率明显低于对照组(P<0.05)，KDM1A蛋白阳性表达率明显高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 2组KLF9和KDM1A蛋白阳性表达率 n=63,例(%)

2.3 神经胶质瘤患者癌组织中KLF9和KDM1A表达与临床病理特征的关系 神经胶质瘤患者癌组织中KLF9和KDM1A蛋白阳性率均与患者年龄、性别、肿瘤大小和KPS评分无关(P>0.05)，与病理分型有关(P<0.05)。见表4。

表4 神经胶质瘤患者癌组织中KLF9和KDM1A表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.4 神经胶质瘤癌组织中KLF9和KDM1A表达与患者预后的关系 对神经胶质瘤患者随访36个月，生存24例，死亡39例。绘制神经胶质瘤患者术后1～36个月KLF9阳性、阴性患者及KDM1A阳性、阴性患者生存曲线。KLF9阳性患者及阴性患者3年总生存率分别为85.71%(6/7)、32.14%(18/56)，差异有统计学意义(P<0.05)。KDM1A阳性患者及阴性患者3年总生存率分别为27.08%(13/48)、73.33%(11/15)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 神经胶质瘤癌组织中KLF9表达3年生存曲线

图2 神经胶质瘤癌组织中KDM1A表达3年生存曲线

2.5 影响神经胶质瘤患者预后的因素分析 单因素分析显示，KLF9表达是影响神经胶质瘤患者预后的保护因素，KDM1A表达和病理分型均是影响神经胶质瘤患者预后的危险因素。多因素分析显示，KLF9表达是影响神经胶质瘤患者预后的独立保护因素(HR=0.75，95%CI为0.64～0.87，P<0.05)，而KDM1A表达是影响神经胶质瘤患者预后的独立危险因素(HR=2.56，95%CI为1.84～3.56，P<0.05)。见表5。

表5 影响神经胶质瘤患者预后的因素分析

3 讨论

神经胶质瘤是最常见原发性脑肿瘤，根据胶质细胞分为星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤和星形细胞加少突细胞混合胶质瘤[11]。神经胶质瘤又可根据WHO分类标准分为：低度恶性组(WHO Ⅰ/Ⅱ)和高度恶性组(WHO Ⅲ/Ⅳ)，其中高度恶性胶质瘤(Ⅲ/Ⅳ级)5年病死率在肿瘤中位于第3位，仅次于胰腺癌和肺癌[12]。目前神经胶质瘤最有效的治疗方式为手术切除和放疗，但对于延长患者生存期效果并不明显[13,14]。因此，寻找有效生物靶点对神经胶质瘤的治疗至关重要。

KLF家族蛋白在哺乳动物中高度保守，共17个成员，按照结构同源性可分为：KLF Ⅰ家族、KLF Ⅱ家族和KLF Ⅲ家族[15]。KLF家族成员在分化、发育及恶性肿瘤发展的关键生物学过程中发挥重要调节作用[16]。KLF9属于KLF Ⅲ家族，此家族成员与转录抑制物SIN3A相互作用，从而发挥抑制功能。Brown等[17]研究证明，在结直肠癌中KLF9 mRNA转录和蛋白质水平下降，KLF9全部或部分丧失可促进结肠肿瘤发生。Zhang等[18]研究发现，KLF9在神经胶质瘤中呈低表达，其低表达可促进神经胶质瘤细胞增殖，KLF9与miR-21启动子相互作用，能够抑制miR-21表达并导致细胞周期停滞。KDM1A是第一个被发现的脱甲基酶，通过改变基因启动子上组蛋白表观遗传进而调节基因表达程序。KDM1A对于维持人类胚胎干细胞未分化和调节神经干细胞的增殖、分化至关重要[19]。研究发现，KDM1A在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达上调[20]。Sareddy等[21]研究表明，KDM1A在胶质瘤干细胞中高表达，抑制其表达可降低胶质瘤干细胞的干性并诱导其分化和凋亡。

本研究检测KLF9和KDM1A在神经胶质瘤组织中的表达情况，发现试验组KLF9 mRNA表达及蛋白阳性率均明显低于对照组，试验组KDM1A mRNA表达及蛋白阳性率明显高于对照组，此结果与Zhang等[18,21]研究结果类似，提示KLF9和KDM1A可能参与神经胶质瘤的发生发展；神经胶质瘤患者癌组织中KLF9和KDM1A蛋白阳性率均与患者年龄、性别、肿瘤大小和KPS评分无关，与病理分型有关，提示KLF9和KDM1A表达可能会影响神经胶质瘤的部分病程进展；绘制神经胶质瘤患者术后1-36个月生存曲线，发现KLF9阳性患者3年总生存率明显高于KLF9阴性患者，KDM1A阳性患者3年总生存率明显低于KDM1A阴性患者，提示KLF9阴性及KDM1A阳性表达均对神经胶质瘤起预后不良效果有关；Cox回归分析显示，KLF9表达是影响神经胶质瘤预后的独立保护因素，KDM1A表达是影响神经胶质瘤预后的独立危险因素，提示上调KLF9表达或抑制KDM1A表达可能会提高神经胶质瘤患者的预后效果。

综上所述，神经胶质瘤患者癌组织中KLF9呈低表达，KDM1A呈高表达，二者的表达均与肿瘤病理分型有关，KLF9表达是影响神经胶质瘤患者预后的独立保护因素，KDM1A表达是影响神经胶质瘤患者预后的独立危险因素，均与患者预后密切相关，有望成为神经胶质瘤的潜在治疗靶点。但本研究样本量较少，或存在一定的局限性，日后将继续扩大样本量，并探究KLF9和KDM1A成为神经胶质瘤治疗靶点的可行性。