五指精蓝颗粒质量标准研究

肖 明，谭安蔷，罗宇东，李芳婵，韦日红

（1.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

五指精蓝颗粒由五指毛桃、黄芪、绞股蓝、黄精、人参等药材组成，具有调节免疫力、抗疲劳、健脾祛湿等功效，临床用于防治慢性疲劳综合征。五指毛桃为处方中的君药，主要成分为补骨脂素，临床用于脾虚浮肿、肺痨咳嗽、风湿疼痛、慢性支气管炎、腰酸背痛等［1］。黄芪具有抗氧化、抗疲劳、防衰老、保护心脑血管和肾脏等作用［2］，人参可提高机体免疫力［3］，两者共为臣药。本研究采用薄层色谱法对五指精蓝颗粒处方中五指毛桃、黄芪、人参进行定性分析，采用高效液相色谱法测定处方中补骨脂素的含量，为五指精蓝颗粒的质量控制提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器 ME104E/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SG250HE型超声清洗仪（上海冠特超声仪器有限公司）；XMTD-8222型高效液相色谱仪（安捷伦Agilent科技有限公司）。

1.2 试药 五指精蓝颗粒（批号：20190301、20190302、20190303、20190304、20190401、20190402、20190403、20190404、20190501、20190502）由广西中医药大学附属制药厂提供；补骨脂素、五指毛桃对照药材、人参对照药材、黄芪对照药材由中国食品药品检定研究院提供；乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 五指毛桃的薄层鉴别

2.1.1.1 供试品溶液的制备 取适量五指精蓝颗粒样品，研细，称取5 g于三角瓶中，加入30 ml乙酸乙酯超声提取30 min，冷却后，滤过，滤液蒸干，残渣加适量乙酸乙酯溶解，定容至2 ml，即得。

2.1.1.2 对照药材溶液的制备 称取五指毛桃对照药材粉末约5 g，按照“2.1.1.1”供试品溶液的制备方法操作，即得五指毛桃对照药材溶液。

2.1.1.3 阴性样品对照溶液 按处方制备缺五指毛桃的阴性样品，研细，称取5 g，按照“2.1.1.1”供试品溶液的制备方法操作，制成缺五指毛桃阴性对照溶液。

2.1.1.4 补骨脂素对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素对照品2 mg，用少量甲醇溶解，定容至10 ml量瓶，即得补骨脂素对照品溶液。

按《中华人民共和国药典》2015年版通则0502薄层色谱法［4］操作，精密吸取以上4种溶液各5µl，分别点在同一块薄层硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸-三氯甲烷（18∶6∶0.8∶5）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图1。供试品在与对照药材、对照品色谱相应位置上出现相同的荧光斑点，而阴性样品色谱在相应位置上未出现斑点，表明阴性样品对鉴别无干扰。

图1 五指毛桃TLC色谱图

2.1.2 黄芪的薄层鉴别

2.1.2.1 供试品溶液的制备 取五指精蓝颗粒样品，研细，称取3 g于三角瓶中，加入95%乙醇30 ml超声30 min，滤过，弃去滤渣，滤液水浴蒸干，残渣用0.3%氢氧化钠溶液10 ml溶解，滤纸过滤。滤液置于小烧杯中，用稀盐酸将pH值调至5～6，再加入乙酸乙酯10 ml，分液漏斗振摇提取，静置分层，取上层乙酸乙酯试液。用无水硫酸钠溶液湿润后的滤纸过滤，滤液用蒸发皿置于水浴锅上加热蒸干，其剩下的残渣用适量乙酸乙酯溶解，并将其转移至2 ml量瓶中定容至刻度，作为五指精蓝颗粒供试品溶液，备用。

2.1.2.2 对照药材溶液的制备 称取黄芪对照药材粉末2 g，按“2.1.2.1”方法制备，制得黄芪对照品药材溶液。

2.1.2.3 阴性样品溶液 按处方制备不含黄芪的阴性样品，并按“2.1.2.1”方法制备得缺黄芪的阴性样品溶液。

精密吸取以上3种溶液各5µl，分别点在同一块薄层硅胶G薄层板上，展开剂为甲烷-甲醇（10∶1），展开，晾干，置装有饱和氨蒸气的展开缸中熏至斑点显色，取出，紫外光灯（365 nm）下检视。见图2。五指精蓝颗粒供试品在与黄芪对照药材相应位置上有相同颜色的荧光斑点，而阴性样品在相应位置上无斑点出现。

图2 黄芪TLC色谱图

2.1.3 人参的薄层鉴别

2.1.3.1 对照药材溶液的制备 称取人参对照药材粉末约1.5 g，加入40 ml三氯甲烷溶液，加热回流提取1 h，待试剂冷却后，过滤除去三氯甲烷溶液，药渣挥干三氯甲烷溶液，置于三角瓶中，用适量水湿润，加入水饱和正丁醇溶液10 ml超声提取30 min，放冷，滤过，滤液装入分液漏斗中，加入3倍量氨水溶液，振摇提取，静置等待分层，取上层溶液，放入蒸发皿中用水浴锅加热蒸干，残渣加适量甲醇溶解，并转移至2 ml量瓶中定容至刻度，作为人参药材对照品溶液。

2.1.3.2 供试品溶液的制备 取五指精蓝颗粒样品研细，称取约3 g，加三氯甲烷溶液30 ml在分液漏斗中振摇提取，共2次，静置分层后，分取上层溶液合并备用。用水饱和正丁醇溶液20 ml振摇提取，共5次，取上层溶液，合并5次提取液。用氨水试液振摇洗涤2次，每次80 ml，洗涤后取上层正丁醇溶液，合并2次提取液，水浴蒸干。剩余的残渣加入10%乙醇溶液10 ml溶解，经D型大孔吸附树脂柱洗脱（内径1.5 cm，长12 cm），先以50 ml纯水洗脱，然后再以40%乙醇30 ml洗脱，弃去洗脱液；加入70%乙醇溶液50 ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干后用适量甲醇溶解，并转移至2 ml量瓶中定容至刻度，作为供试品溶液，备用。

2.1.3.3 阴性样品溶液的制备 根据处方工艺制备不含人参的阴性样品，按“2.1.3.2”项下方法制得缺人参的阴性样品溶液。

精密吸取上述3种溶液各5µl，点于同一块薄层硅胶G板上，用［正丁醇-乙酸乙酯-水（5∶1.2∶6）的上层溶液］-甲醇（10∶1）的混合溶液作为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液使其湿润，晾干，放入烘箱中100℃加热至斑点显色清晰，紫外光灯（365 nm）下检视。见图3。结果显示，供试品溶液在与人参对照药材色谱在相应位置上出现相同颜色斑点，而阴性样品色谱在相应位置上无斑点出现。

图3 人参TLC色谱图

2.2 补骨脂素的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素对照品5.09 mg，置于10 ml容量瓶中，用少量甲醇（色谱纯）溶解并定容至刻度，即得到浓度为含0.509 mg/ml的补骨脂素对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取适量五指精蓝颗粒样品研细，精密称定3.0 g置于具塞锥形瓶中，加入75%乙醇溶液25 ml超声提取30 min，静置冷却后用75%乙醇溶液补足重量，振摇均匀，过滤，滤液用蒸发皿水浴蒸干，剩余残渣加少量甲醇溶解，置于10 ml量瓶中用甲醇定容至刻度，摇匀，即得五指精蓝颗粒供试品溶液。

2.2.3 缺五指毛桃的阴性样品溶液的制备 按处方制备缺五指毛桃的五指精蓝颗粒阴性样品，取适量阴性样品，研细成粉末，精密称取约3 g，按照“2.2.2”五指精蓝颗粒供试品溶液的操作步骤，制备得阴性样品溶液，备用。

2.2.4 色谱条件参考文献［5］选定色谱条件。色谱柱：Gemini C18110A（5µm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液（40∶60）；进样量：10µl；流速：1.0 ml/min；柱温：40℃；检测波长：245 nm。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及缺五指毛桃的阴性溶液各10µl，依次注入高效液相色谱仪中，按上述“2.2.4”色谱条件进行测定，结果补骨脂素基线分离良好，且其它成分对测定无干扰。结果见图4。

图4 五指精蓝颗粒HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察 取上述补骨脂素对照品溶液，分别制成浓度为0.203 6 mg/ml、0.407 2 mg/ml、0.814 4 mg/ml、1.221 6 mg/ml、1.628 8 mg/ml、2.036 0 mg/ml的对照品系列溶液。精密吸取系列溶液各10µl，按照“2.2.4”色谱条件进样测定峰面积。以进样量浓度作为横坐标（X），峰面积作为纵坐标（Y）进行线性回归，得到回归方程为：Y=58 234.73X+776 018 415。结果显示，补骨脂素进样浓度在0.203 6～2.03 6 mg/ml范围内与峰面积呈线性关系，相关系数为r=0.999 8。

2.2.7 精密度试验 取上述“2.2.1”补骨脂素对照品溶液，精密吸取1 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀释，定容，摇匀，精密吸取稀释后的对照品溶液10µl，依照“2.2.4”色谱条件进行测定，重复操作6次，记录峰面积。结果平均峰面积为1 288 396.333，峰面积RSD为0.20%（n=6），结果显示该仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取五指精蓝颗粒样品，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液。分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后精密吸取10µl注入高效液相色谱仪中，测定补骨脂素含量。求得峰面积分别为8 262 010、8 242 062、8 258 315、8 226 052、8 195 624、8 174 613、8 198 844，平均峰面积为8 222 502，RSD为0.41%（n=7），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取同一批五指精蓝颗粒样品，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液6份，按上述“2.2.4”色谱条件测定方法测定，记录峰面积，计算出含量为0.818 mg/g、0.827 mg/g、0.825 mg/g、0.821 mg/g、0.818 mg/g、0.823 mg/g，平均含量为0.822 mg/g，RSD为0.45%（n=6），可见该测定方法的重复性良好。

2.2.10 加样回收试验 取同一批已知补骨脂素含量的五指精蓝颗粒样品共9份，每份约0.6 g（含补骨脂素0.861 2 mg/g），研末，按照1∶1比例分别加入补骨脂素对照品，分别精密吸取1 ml对照品溶液加入到样品中，混合均匀，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。再按照“2.2.4”项下的测定方法对样品进行含量测定。经计算，样品平均回收率为99.53%，RSD为1.11%（n=9），结果表明该方法回收率良好。见表1。

表1 加样回收率结果 （n=9）

2.2.11 样品含量测定 分别取10份不同批号的五指精蓝颗粒样品，每份约1 g，精密称定，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液和补骨脂素对照品溶液各10µl，按照“2.2.4”测定方法进样测定。见表2。

表2 五指精蓝颗粒中补骨脂素的含量测定结果（n=10）

按照拟定方法测定含量，五指精蓝颗粒每袋以10 g计算，10批样品补骨脂素总量分别在7.29～8.39 mg/袋之间，考虑到每批药材含量不同、制备工艺等因素的影响，故暂制定限度为“本品每袋（10 g）含五指毛桃以补骨脂素总量计算，不得少于7.0 mg”。

3 讨论

本研究对五指精蓝颗粒中的五指毛桃、黄芪、人参药材进行了薄层鉴别，其中五指毛桃药材的鉴别参考了《中华人民共和国药典》2015年版通则0502方法，展开剂为正己烷-乙酸乙酯-甲酸-三氯甲烷（20∶5∶0.7∶4），但在紫外灯光下观察，斑点显示分离得不够清晰，边缘效应也较明显；经过调整展开剂的比例，最终选用正己烷-乙酸乙酯-甲酸-三氯甲烷（18∶6∶0.8∶5）的混合溶液为展开剂，可清晰观察到五指精蓝颗粒样品在与五指毛桃对照药材、补骨脂素对照品色谱相对应位置上出现相同的荧光斑点，且分离度良好，而缺五指毛桃阴性样品的色谱图上没有出现相应斑点。

在黄芪药材的鉴别中，曾经尝试使用多种展开剂进行薄层鉴别，如以三氯甲烷-甲醇-水（15∶13∶5）的溶液为展开剂，展开，并喷以10%硫酸乙醇溶液使其湿润，但在紫外灯光下查看斑点不清晰。经参照药典方法，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）为展开剂，展开，经饱和氨气熏后，在紫外灯光下观察，可清晰看到色谱图上有清晰的斑点，且五指精蓝颗粒供试品溶液与黄芪药材对照品溶液在相应位置上有相同斑点，而缺黄芪的阴性样品溶液在相同位置上无相应斑点。

五指毛桃的主要成分是补骨脂素，具有抗凝血、增强免疫力、抑制Hela细胞生长、抗菌、抑制肿瘤等作用，并且对红细胞系统造血有一定的促进作用［6-7］。因此，本研究选择将补骨胎素作为五指精蓝颗粒中五指毛桃的指标性成分。经尝试多种色谱条件，最终确定使用乙腈-0.2%磷酸作为流动相，进样量为10µl，流速为1.0 ml/min，柱温为40℃，检测波长为245 nm，结果分离度良好，阴性样品对测定无干扰，表明该方法可用于本品的含量测定。