银杏叶提取物对肺纤维化模型大鼠TGF-β1、MMP-9及NF-κB表达的影响

卢岳虹，潘 玲，黄茹妍，罗湘蓉，谭玉萍，黎展华

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，其病理特点主要是肺成纤维细胞（fibroblast，FB）不断增生和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，最后造成肺组织结构的破坏，最终导致慢性呼吸衰竭［1-2］。近年来肺纤维化的发病率不断升高，目前，临床常用吡非尼酮、尼达尼布两种药物治疗肺纤维化，可以减缓疾病的进展，但并不能完全有效地降低死亡率［3］，且治疗费用较高，肺纤维化患者的预后仍然很差。银杏叶为银杏科植物银杏的叶，其性味苦、涩、平，具有化痰平喘敛肺、活血祛瘀、通络止痛、补气养心等功效，早在唐代的《食疗本草》中就有银杏叶可用于治疗心悸怔忡、肺虚咳喘等病症的记载［4］。银杏叶提取物主要含有黄酮类、萜类内酯、氨基酸、微量元素等多种化学成分［5］。熊红等［6］研究发现，银杏叶提取物在早期肺泡炎阶段可抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）表达，且在肺纤维化进展中其抑制效果明显优于强的松。本实验观察银杏叶提取物对PF模型大鼠肺组织转化生长因子β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及核转录因子-κB（NFκB）表达的影响，为银杏叶提取物治疗PF挖掘病理生理学的潜力依据，寻找可靠的多环节调控的中医药治疗方法，从而抑制疾病进展。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠72只，体质量180～200 g，动物由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（湘）2016-0002。大鼠饲养于广西中医药大学实验动物中心（温度22～25℃，湿度60%～70%），可自由饮水及进食，饲养观察1周。

1.2 药物与试剂 博来霉素（索莱宝生物科技有限公司）；吡非尼酮（北京康蒂尼药业有限公司，规格：每粒100 mg）；银杏叶提取物（德国威玛舒培博士药厂，规格：每片40 mg）；大鼠TGF-β1酶联免疫试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；MMP-9以及NF-κB免疫组化试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 仪器 BX51T-PHD-J11型显微镜（日本奥林巴斯）；RM2015型石蜡切片机（德国莱卡）；5430/5430R型离心机（德国Eppendorf公司）；MDF-382E型低温冰箱（日本三洋）；DSHZ-300型恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）。

2 方法

2.1 分组 72只大鼠按随机数字表法分为6组：正常对照组、肺纤维化模型组、吡非尼酮组、银杏叶提取物高剂量组、银杏叶提取物中剂量组、银杏叶提取物低剂量组，每组12只。

2.2 PF大鼠造模 参考文献［7］方法进行造模。以10%水合氯醛溶液（3 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，仰卧位剪开颈部皮肤，镊子钝性分离皮下组织以暴露气管，造模组气管内注入博来霉素溶液（5 mg/kg），正常对照组气管内注入生理盐水（1 ml/kg），均沿气管斜刺注入，注入完毕后直立大鼠并左右旋转10 s，使药物分布均匀。最后缝合切口，待大鼠苏醒。

2.3 给药及处理 造模24 h后正常饮水进食，造模后第8 d各组随机处死1只大鼠，取全肺组织行病理学检测确认造模是否成功，检测于广西中医药大学附属瑞康医院病理科进行。确认造模成功当天即造模后第8 d开始灌胃给药，连续灌胃21 d，正常对照组每日予生理盐水10 ml/kg灌胃；肺纤维化模型组每日予生理盐水10 ml/kg灌胃；吡非尼酮组每日予吡非尼酮溶液50 mg/kg灌胃；银杏叶提取物高剂量组每日予银杏叶提取物100 mg/kg灌胃；银杏叶提取物中剂量组每日予银杏叶提取物50 mg/kg灌胃；银杏叶提取物低剂量组每日予银杏叶提取物25 mg/kg灌胃。各组灌胃容积均为10 ml/kg，造模后29 d处死大鼠取材。由于纤维化模型组在造模过程中有3只大鼠死亡，因此造模后29 d各组均取8只大鼠进行下一步研究。

2.4 取材 气管内给药后第29 d，按照大鼠体重比例麻醉，麻醉成功后，腹主动脉采血处死大鼠，采血后室温静置2 h，后放入离心机低速（3 000 r/min）离心20 min，取上层血清保存于-80℃冰箱中待用，取右肺叶置于4%多聚甲醛的容器中固定待用。

2.5 检测指标及方法

2.5.1 肺组织病理检测 将于4%多聚甲醛溶液中固定的右肺叶行苏木精-伊红染色法（hematoxylineosin staining，HE）染色、Masson染色，严格按说明书执行。根据SZAPIEL等［8］描述的半定量分级系统方法，在光学显微镜下分别评估肺组织肺泡炎症和纤维化程度。

2.5.2 血清TGF-β1测定 取已离心的各组大鼠上层血清，采用ELISA法测定血清中TGF-β1含量，具体方法参见ELISA试剂盒说明书进行检测。

2.5.3 免疫组化 取固定的右肺叶，常规石蜡包埋，行MMP-9和NF-κB免疫组化，光镜下拍摄免疫组化染色图片，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析，记录各组织积分光密度（integral optical density，IOD）以及Area，再计算IOD/Area，以此作为该肺组织的蛋白表达量。

2.6 统计学方法 采用SPSS21.0对数据进行分析，所有实验数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 HE染色结果 正常对照组：大鼠肺组织肺泡结构基本清晰，无明显炎症反应。肺纤维化模型组：大鼠肺组织表现为肺泡结构紊乱，肺泡融合或塌陷，肺泡壁增厚变形，管腔狭窄，可见大量炎性细胞浸润。吡非尼酮组：大鼠肺组织肺泡结构破坏较少，肺泡间隔少许增宽，可见少量炎症细胞浸润。银杏叶提取物高剂量组：大鼠肺组织肺泡结构部分破坏，肺泡腔部分融合，可见部分炎症细胞浸润。银杏叶提取物中剂量组：大鼠肺组织部分肺泡结构被破坏，肺泡壁稍有增厚，可见少量炎症细胞浸润。银杏叶提取物低剂量组：大鼠肺组织肺泡结构部分破坏，肺泡壁增厚，部分肺泡融合或塌陷，有炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理形态（HE染色，×100）

3.2 Masson染色结果 正常对照组：大鼠肺组织结构正常，气管及血管周围有少量呈蓝色的胶原纤维。肺纤维化模型组：大鼠肺组织结构紊乱，蓝色胶原纤维明显增厚，呈条状或大片沉积。吡非尼酮组：大鼠肺组织结构少量被破坏，可见散在蓝色胶原纤维沉积，呈点状、絮状沉积。银杏叶提取物高剂量组：肺组织结构破坏较少，可见散在线性及絮状纤维化病灶。银杏叶提取物中剂量组：肺组织结构被破坏，肺泡融合塌陷伴有较明显胶原纤维沉积。银杏叶提取物低剂量组：肺组织肺泡间隔增厚，蓝色胶原纤维呈絮状沉积。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理形态（Masson染色，×100）

3.3 各组大鼠肺组织肺泡炎症积分及纤维化程度 比较 见表1。

表1 各组大鼠肺组织肺泡炎症积分及纤维化程度比较 （分，x±s）

表1结果显示，与正常对照组比较，肺纤维化模型组肺泡炎症积分、纤维化积分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与肺纤维化模型组比较，吡非尼酮组及银杏叶提取物高、中、低剂量组肺泡炎症积分、纤维化积分均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；而吡非尼酮组与银杏叶提取物高、中、低剂量组比较，肺泡炎症积分、纤维化评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.4 各组大鼠血清中TGF-β1水平比较 见表2。

表2 各组大鼠血清TGF-β1水平比较 （pg/ml，x±s）

表2结果显示，与正常对照组比较，肺纤维化模型组血清中TGF-β1含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与肺纤维化模型组比较，吡非尼酮组及银杏叶提取物高、中、低剂量组血清中TGF-β1含量降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与吡非尼酮组比较，银杏叶提取物中、低剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05），而银杏叶提取物高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.5 免疫组化检测肺组织MMP-9、NF-κB的表达情况

3.5.1 各组大鼠肺组织MMP-9、NF-κB免疫组化染色结果 见图3、图4。

图3 各组大鼠肺组织MMP-9的表达情况（免疫组化，×400）

图4 各组大鼠肺组织NF-κB的表达情况（免疫组化，×400）

3.5.2 各组大鼠肺组织MMP-9、NF-κB表达水平 比较 见表3。

表3 免疫组化检测肺组织MMP-9、NF-κB的表达情况 （IOD/Area，x±s）

表3结果显示，与正常对照组比较，肺纤维化模型组大鼠肺组织中MMP-9、NF-κB表达染色IOD值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与肺纤维化模型组比较，吡非尼酮组及银杏叶提取物高、中、低剂量组MMP-9、NF-κB表达明显降低（P＜0.01）；吡非尼酮组与银杏叶提取物中、低剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而与银杏叶提取物高剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨 论

肺纤维化是一种呈进行性发展的慢性呼吸系统疾病，以肺泡壁炎症细胞浸润、肺泡间隔增宽增厚和肺间质纤维化为主要病理表现，目前发病机制尚不明确，多认为是多种途径共同作用所致。气管注射博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型，在造模后第28 d可观察大鼠肺纤维化改变，且病理改变与人类肺纤维化相似［7］。本实验中肺纤维化模型组第29 d的HE结果显示，肺泡结构紊乱，肺泡融合或塌陷，肺泡壁增厚变形，管腔狭窄；Masson染色结果显示肺组织大量蓝色胶原纤维沉积，以上结果提示本实验大鼠肺纤维化模型造模成功。当前，吡非尼酮作为治疗特发性肺纤维化指南中推荐使用的药物，具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等作用，可以延缓肺纤维化的进展［9］。但由于吡非尼酮价格高，临床应用未普遍，且研究表明吡非尼酮并不能减低肺纤维化死亡率［3］。本研究显示，经银杏叶提取物与吡非尼酮干预后，肺纤维化大鼠肺组织肺泡炎症、纤维化以及TGF-β1、MMP-9、NF-κB表达水平均较肺纤维化模型组降低，说明银杏叶提取物在肺纤维化模型大鼠中显示出缓解肺泡炎和抗纤维化的作用。

TGF-β1是肺纤维发展过程中的关键性因子之一，广泛参与肺纤维化的发展过程。参与调控成纤维细胞的分化、迁移等过程，促进ECM的过度分泌，诱导肺泡上皮细胞-上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），激活下游的促纤维化因子或信号级联，促进纤维化的发展。MMP-9可以降解ECM，改变ECM与间质胶原的比例，而启动肺纤维［10］，同时，TGF-β1可刺激MMP-9产生，MMP-9亦能激活TGF-β1，从而促进活性TGF-β1的积聚［11］。NF-κB可以通过对肺泡巨噬细胞、TGF-β等多种细胞因子过度表达，介导肺泡炎和肺纤维化进程。NF-κB是TGF-β1表达的上游调节基因，NF-κB激活后与TGF-β1的启动子结合，诱导TGF-β1的表达［12］。NF-κB还可以与MMP-9的启动子直接结合，对EMT起调节作用［13］。慢性阻塞性肺疾病因病情加重会出现肺间质纤维，杨红梅等［14］在对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的研究中发现，银杏叶提取物可以使大鼠肺组织中MMP-9和金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的阳性细胞表达率明显降低，并且使MMP-9与TIMP-1的比例趋于平衡，可达到延缓或抑制肺纤维化的发生。因此，本实验选择TGF-β1、MMP-9以及NF-κB作为观察指标，观察银杏叶提取物通过抑制其表达水平而影响肺纤维化的发展。本实验结果显示，肺纤维化模型大鼠中TGF-β1、MMP-9以及NF-κB表达水平均升高，银杏叶提取物干预后使原本升高的表达因子得到抑制，改善了肺纤维化的进展，表明银杏叶提取物可能通过抑制TGF-β1、MMP-9以及NF-κB表达水平，从而改善肺纤维化。

中医学上多将肺纤维化归属于“肺痹”和“肺痿”范畴。“肺痹”之病名最早见于《素问·玉机真脏论》，因情志、外感等多种因素导致肺肾亏虚，气虚血瘀，脏腑经络痹阻不通而发病。“肺痿”病名源于张仲景的《金匮要略》。有研究表明，肺纤维化以“气虚”“血瘀”为核心病理因素，痰瘀互结、脏腑气虚、肺络痹阻不通为其发病关键，辨证分型主要分为脏腑气虚类及气滞血瘀类，因此补益肺肾、益气活血化瘀可作为治疗肺纤维化的主要方法［15-16］。银杏叶作为治疗肺虚咳喘历史悠久的中药，应用于临床历史悠久，银杏叶提取物目前也广泛应用于治疗和预防呼吸系统疾病，且疗效显著。杨志晖等［17］在研究银杏叶提取物对高脂血症大鼠的影响中发现，银杏叶提取物可以通过多种途径抑制NF-κB的表达，从而减少细胞凋亡、内皮损伤和炎症反应，这一研究与本研究银杏叶提取物抑制NF-κB的表达结果一致。

综上所述，银杏叶提取物可抑制肺纤维化大鼠肺组织的炎症及纤维化程度，下调TGF-β1、MMP-9与NF-κB表达水平，从而发挥其抑制或延缓肺纤维化的作用。