MNNG综合法诱导大鼠胃癌形成的胃组织学与超微结构研究

林倚莉，王煜姣，贾庆玲，谭人千，易志荣，李 莉，凌江红，

（1.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021；3.重庆市永川区中医院，重庆 402160）

胃癌（gastric cancer，GC）是最常见的消化道肿瘤，由于诊断晚、预后差，成为全球癌症死亡的第三大原因，其发病率高居全球恶性肿瘤第五位。流行病学调查研究结果显示，我国GC的患病人数每年以2.5%的速度增长［1-2］。胃癌的发生经历了正常胃黏膜-炎症-萎缩-肠上皮化生-异型增生-癌等阶段，其中不完全性肠上皮化生和高级别异型增生病变有更高风险发展为GC［3］。胃黏膜的肠上皮化生和（或）异型增生称为胃癌前病变（gastric precancerous lesions，GPL），是正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段，深入研究GPL对于降低GC的发病率具有重大意义。本课题组采用MNNG综合法诱导GC大鼠，研究该法诱导GPL大鼠和GC大鼠的最佳成模时间，观察GC形成过程中胃组织学与超微结构的变化，以期初步探讨MNNG综合法诱导GC大鼠形成过程中的胃黏膜病变规律。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，4～6周龄，体质量180 g左右，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（桂）2020-0003；使用许可证号：SYXK（桂）2020-0004。实验动物饲养环境：广西医科大学实验动物中心SPF级动物房。

1.2 试剂 N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（货号：M0527）；二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝有限公司（货号：D8370）；水杨酸钠购自阿拉丁试剂（上海）有限公司（货号：S104176）；盐酸雷尼替丁胶囊（佛山手心制药有限公司），0.03%雷尼替丁SPF级大鼠颗粒饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司制作；HE染色及相关试剂耗材由广西医科大学科技楼免疫组化实验室提供；电镜及相关试剂由广西医科大学电镜室提供。

1.3 主要仪器 电子分析天平（日本Shimadzu公司）；组织脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊烘烤片机均为德国Leica公司产品；UC7超薄切片机（德国Leica公司）；HT7700透射电子显微镜（日本日立公司）；BX53F奥林巴斯光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.4 药物配置 取5 g的MNNG粉末，加入DMSO溶液约30 ml，使其充分溶解，再用超纯水定容至浓度为17 mg/ml的母液，置于4℃冰箱避光保存，临用前再取适量母液用超纯水稀释至浓度为170µg/ml。

1.5 动物分组及模型复制 36只大鼠予正常饮食适应性喂养1周后，通过随机数字表法随机分为正常组和模型组各18只，正常组予常规自由饮食，模型组参照文献［4］采用MNNG综合法复制GC大鼠模型：①自由饮用MNNG溶液：取浓度为170µg/ml的MNNG溶液供大鼠自由饮用，每24 h更换1次，饮水瓶用锡箔纸包裹；②饥饱失常法：进食2 d，再禁食1 d；③化学药物损伤法：喂食含有0.03%雷尼替丁的颗粒状SPF级大鼠饲料，于禁食当天下午用2%水杨酸钠溶液10 ml/kg灌胃。由于疫情管控原因，造模第35～46周委托动物中心老师代予170µg/ml的MNNG溶液供大鼠自由饮用，并喂食含有0.03%雷尼替丁的颗粒状SPF级大鼠饲料，此期间内模型组大鼠死亡2只。

1.6 样本采集与观测指标 观察两组大鼠在造模过程中的一般情况，如皮毛光泽、活动度、精神状态、饮食量及体质量变化。分别于造模第20、24、28、32周末从两组中各随机处死3只大鼠，第48周末处死余下的大鼠。剖腹取胃小弯-胃体-胃窦的胃组织全层两块：一块用4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，用于HE染色，光镜下观察胃黏膜病理组织学变化；另一块用4%戊二醛固定，电镜下观察胃黏膜上皮细胞超微结构变化。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠体态正常，皮毛顺滑光泽，精神良好，行动敏捷，饮食饮水量大，大便成形，呈黄色颗粒状。与正常组比较，模型组大鼠体型瘦小，皮毛无光泽，毛发松散，掉毛多，精神倦怠，喜静卧或昏昏欲睡，行动迟缓，饮食饮水量明显减少，体质量显著降低，大便多不成形，色黑，臭秽。

2.2 肉眼观察大鼠胃组织 正常组大鼠胃部外观大小形态正常，剖开胃组织后偶见饲料残渣，胃体部黏膜呈暗粉色，胃窦部黏膜呈粉白色，黏膜表面平整光滑，黏膜皱襞规律排列。与正常组比较，20周、24周模型组大鼠胃部外观体积变小、形态正常，胃体部黏膜呈暗粉色，胃窦部黏膜呈粉黄白色，胃壁变薄，黏膜表面尚平整、欠光滑，皱襞走向紊乱，皱襞变浅。28周胃黏膜表面部分可见散在出血点。32周胃体部黏膜呈浅暗粉色，胃黏膜表面不平整，部分可见颗粒状结节。48周模型组大鼠剖腹后可见胃部胀大，剖开胃组织可见大量臭秽黄褐色液体流出，胃体部黏膜呈淡暗粉色，胃窦部黏膜呈灰白色，胃壁变薄，黏膜表面缺乏光泽、不平整，皱襞走向紊乱，皱襞变浅或消失，胃窦部表面可见大小不规则的结节状肿物。见图1。

图1 肉眼观察下各组胃组织形态

2.3 HE染色观察大鼠胃黏膜病理变化 正常组胃黏膜上皮结构完整，固有层腺体形态正常，排列整齐规律，未见炎性细胞浸润。20周模型组大鼠可见胃小凹加深，腺体腺体排列相对较整齐，形态尚规则。24周、28周模型组大鼠胃黏膜腺体无明显萎缩，腺体拥挤，形态不规则，排列稍紊乱，可见杯状细胞。32周模型组大鼠腺体拥挤，形态不规则，可见复层及背靠背改变，个别腺体囊状扩张，细胞核深染、增大、异型，可见杯状细胞。48周模型组大鼠胃黏膜腺体减少，排列紊乱，细胞核呈柱状或杆状，细胞呈多形性，异型性明显，细胞核浆比增高，胞核增大，胞浆少，嗜碱性，可见较多核分裂象。见图2。

图2 各组大鼠胃黏膜病理观察（×400）

2.4 透射电子显微镜观察大鼠胃黏膜超微结构变化 与正常组比较，模型组大鼠细胞间可见紧密连接数量较多、桥粒数量减少，连接复合体张力微丝减少、消失。20周、24周模型组大鼠胃黏膜表面上皮细胞轻度固缩，细胞核轻度固缩，局部核周隙略显增宽，线粒体数量丰富，略显固缩、较小，线粒体“空泡化”现象，膜内基质电子密度高，嵴扩张，粗面内质网明显扩张，表面有核糖体附着，细胞间隙局部增宽。28周模型组大鼠胃黏膜表面上皮细胞轻度水肿，胞内细胞器略显肿胀，微绒毛稀疏、局部脱落，表面黏液消失，内质网池内可见絮状物聚集，内质网潴留。32周模型组大鼠胃黏膜表面上皮细胞坏死趋势，胞内基质电子密度高，微绒毛脱落，细胞核崩解，核膜消失，染色质游离，线粒体数量减少，黏原颗粒数量减少，大小不一。48周模型组大鼠胃黏膜表面上皮细胞凋亡趋势，胞内细胞器肿胀、空泡变，细胞膜局部破损，细胞器游离，细胞核固缩，异染色质边集，核周隙增宽，个别细胞染色质块状凝集，核碎裂，线粒体明显肿胀、变大，膜内基质变淡，嵴减少。见图3。

图3 各组大鼠胃黏膜上皮细胞超微结构变化（TEM，×5 000）

3 讨论

GPL是正常胃黏膜向GC转变的重要阶段，包括肠上皮化生和（或）异型增生。目前GC及GPL动物模型的造模方法较多，在造模动物的选择上，主要以雄性SD和Wistar大鼠为主，年龄多选择4～8周的未成年大鼠或新生儿鼠，体质量50～200 g不等［5］。在造模方法的选择上，主要有化学药物诱变法、物理方式刺激法、免疫造模法、幽门螺杆菌感染复制法以及手术造模法，其中，因化学药物诱变剂MNNG不依赖于酶的代谢，可直接作用于胃黏膜诱发癌变，模拟人体过多摄入硝酸盐而在胃中产生致癌物质的过程，使其成为目前比较常用的造模方法［6-7］。然而由于单用MNNG造模周期长，它常配合其他因素使用以缩短造模周期［8］。本研究采用MNNG自由饮用、饥饱失常法配合化学药物损伤法复制GC大鼠模型。饥饱失常法模拟人体不规律饮食，水杨酸钠模拟临床中非甾体抗炎药对胃黏膜的损伤，通过对局部胃黏膜的直接刺激引起炎性反应，并通过抑制前列腺素合成，破坏胃黏膜屏障；另外，雷尼替丁可抑制胃酸分泌，与水杨酸钠共同造成胃内环境弱酸性，促使硝酸盐转为亚硝酸盐，加快MNNG诱导作用［9-10］。

胃组织发生恶性肿瘤之前常历经持续多年的癌前病变过程，CORREA［11］于1988年首次提出GC的级联发展模式：慢性浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌，即慢性胃炎“炎癌转化”模式。胃黏膜上皮细胞是器官特异性的“屏障”，在发生感染或损伤时刺激趋化因子产生来诱导快速免疫反应，从而起到保护下层组织的作用［12］。有研究发现［13］，大鼠胃黏膜上皮细胞在GC形成过程中经历着炎性反应-空泡样变与黏液湖-组织异型性-低级别上皮内瘤变与微血管病变-癌变-转移。GC的发生可能与胃上皮损伤引起的一系列细胞反应有关，包括细胞空泡化、质膜透化、内体和溶酶体功能的改变、线粒体功能的破坏、自噬的调节、细胞凋亡、坏死和T细胞活化的抑制等［14-15］。细胞增殖、分化与凋亡均为维持细胞平衡的重要机制，GPL的胃黏膜上皮细胞由于存在一些特异性基因突变，引起细胞的防御应激机制，不能发生凋亡形式的程序性细胞死亡，使胃黏膜上皮细胞处于持续增殖状态，促使其向肿瘤发展［16］。

本研究使用4～6周龄、体质量180 g左右的雄性SD大鼠，采用170µg/ml MNNG溶液自由饮用、喂食含0.03%雷尼替丁饲料、灌服2%水杨酸钠溶液配合饥饱失常法复制GC大鼠模型。模型组大鼠饮食、饮水量减少，体质量减轻，大便不成形，说明GC形成过程中存在消化不良的症状。24周模型组大鼠胃组织皱襞变浅、出现杯状细胞、胃黏膜上皮细胞轻度固缩，出现线粒体“空泡化”现象；28周胃组织表面可见散在出血点、杯状细胞增多、胃黏膜上皮细胞轻度水肿，内质网潴留；32周胃组织表面部分可见颗粒状结节、出现异常增生、细胞坏死趋势，微绒毛脱落，细胞核崩解；48周呈胃癌、细胞凋亡趋势，胞内细胞器肿胀、空泡变。24周模型组大鼠胃组织可见杯状细胞，说明此造模方法可于造模第24周成功建立GPL大鼠模型。32周模型组大鼠胃组织出现异型增生，原实验计划拟对造模第36周和40周大鼠胃组织进行研究，但由于疫情防控期间管理规定未能按计划实施，疫情期间模型组大鼠死亡2只，故动物中心准予开放后仅取造模第48周大鼠胃组织进行研究，发现模型组大鼠均已癌变，因此推测癌前病变向癌症转变的时间可能在32～48周。